血液中肺炎鏈球菌的AFLP快速檢測方法的建立

[摘要] 目的 建立擴增片段長度多態性（AFLP）快速檢測血液中肺炎鏈球菌的方法。方法 針對肺炎鏈球菌的管家基因16SrRNA基因設計特異引物，優化反應條件，建立肺炎鏈球菌的AFLP檢測方法。通過對模擬臨床血液感染細菌標本的檢測，評價該方法的特異性和靈敏度。結果 7個模擬臨床血液感染肺炎鏈球菌標本經AFLP法檢測，結果均為陽性；15個模擬臨床血液感染非肺炎鏈球菌標本經該法檢測，結果均為陰性；該法檢測血液標本中肺炎鏈球菌的靈敏度為1.5×104cfu/mL。結論 建立的AFLP方法檢測血液中肺炎鏈球菌簡便快速，特異性好、靈敏度高，適合肺炎鏈球菌血流感染的早期診斷。

[關鍵詞] 肺炎鏈球菌；擴增片段長度多態性；快速檢測

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）34-83-03

Establishment and Application of AFLP Method for Rapid Diagnosis of Streptococcus Pneumoniae in Blood1

YU Lingling1 WANG Xinlin2 WU Xiuji1 ZHENG Xueyun2

1.The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027， China；2.The First People's Hospital of Longwan， Wenzhou 325024， China

[Abstract] Objective To establish a Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) method for rapid diagnosis of Streptococcus pneumonia. Methods Based on the 16S rRNA nucleic sequence of streptococcus pneumonia， a pair of primers was designed for AFLP. The reaction conditions were optimized， and the specificity， sensitivity， and practicability of AFLP were tested using 7 streptococcus pneumonia strains and 15 non-streptococcus pneumonia strains in blood. Results All the 7 strains of streptococcus pneumonia in blood yielded positive results in AFLP， and the 15 strains of other bacteria in blood all showed negative results. The results of streptococcus pneumonia count showed that AFLP was capable of detecting streptococcus pneumonia at a level as low as 1.5×104cfu/ml in blood. Conclusion The established AFLP method has high specificity and sensitivity for detecting streptococcus pneumonia in blood and is applicable in field of rapid diagnosis of Streptococcus pneumoniae in blood.

[Key words] Streptococcus pneumoniae; Amplified fragment length polymorphism; Rapid detection

肺炎鏈球菌是一種條件致病菌，當機體免疫力下降時可以致病，肺炎鏈球菌是社區獲得性肺炎、腦膜炎、中耳炎及敗血癥等的主要病原體[1-2]。血液中檢出肺炎鏈球菌也很常見，國內多見報道。目前對肺炎鏈球菌的診斷主要依賴傳統培養法進行檢測，但是培養法需要對微生物分離、培養和鑒定等，檢測存在著耗時長、靈敏度低、操作繁瑣等缺點，對臨床快速診斷尤其是侵襲性感染的診斷不及時，造成臨床治療上的延誤。隨著分子生物學技術的發展，肺炎鏈球菌的快速診斷研究進展迅速，有環介導等溫核酸擴增技術（LAMP）、PCR檢測核糖體（16S rRNA）、熒光定量PCR、熒光探針等[3-6]從基因/基因組的層面對肺炎鏈球菌進行快速診斷。本研究擬建立擴增片段長度多態性（AFLP）方法以檢測肺炎鏈球菌，并對模擬臨床血液感染細菌標本進行檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

制備模擬臨床血液感染細菌標本所用菌株為2010年4～6月溫州醫學院附屬第二醫院及溫州市龍灣區第一人民醫院臨床分離株；質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619，購自衛生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器

Microscan Walkaway-90SI 型全自動細菌鑒定儀（德國西門子公司）、VITEK-32全自動微生物分析儀、PCR儀（德國Eppendorf 公司產品）、電泳儀（美國BIO. RAD公司）、凝膠成像系統（上海天能公司）。

1.3 試劑

PCR試劑和DNA Marker I 購于TaKaRa大連寶生物公司，引物參照文獻設計[7]，由上海生工生物技術有限公司合成。限制性內切酶EcoR I、Mse I 購自Fermentas公司，DNA 分子量對照購自MBI公司。接頭EcoR I Adapter，Mse I Adapter、引物序列（P1、P2），見表1。

1.4 菌種鑒定及藥敏試驗

挑選血平板上臍窩狀的可疑菌落分純，同時做奧普托欣（Optochin）試驗，再用VITEK-32全自動微生物分析儀GPI卡鑒定到種。試劑盒ATBSTREP5為法國生物梅里埃公司產品，判斷標準參照CLSI（2010版）標準。

1.5 AFLP 實驗

根據胡農等[8]報道的方法改進后用于實驗。

1.5.1模擬臨床血液感染細菌標本制備及DNA的提取 挑3-5個菌落調制成1麥氏點菌液.相當菌液初始濃度為3.0×108cfu/mL，與血液對倍混合，即得到系列濃度為1.5×108cfu/mL模擬臨床血液感染細菌標本。收集所配制的臨床血液細菌標本置入含50μL裂解液（0.5%非離子去污劑NP40配制的濃度為200ng/mL蛋白酶K溶液）的0.5mL離心管內，置55℃水浴1h，置95℃水浴滅活15min，14000r/min，離心30s。上清液即為擴增檢測的模板液，用1%瓊脂糖電泳檢測基因組DNA，并用紫外分光光度計定量。

1.5.2 基因組DNA的雙酶切 取基因組DNA各2μL，內切酶EcoR I 5U、MseI 5U，10×Buffer 4μL，補水至40μL，先在37℃水浴5h，然后轉入65℃水浴2h，用1%瓊脂糖電泳檢測酶切產物。

1.5.3 接頭的連接反應 取酶切產物20μL，EcoR I Adapter、Mse I Adapter 各1μL，T4 DNA連接酶0.5μL，10×Buffer 3μL，補水至30μL，22℃，連接過夜。

1.5.4 PCR擴增 PCR擴增反應體系體積為25μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，dNTP（100mmol/L）2μL，模板DNA 3μL，MgCl2（25mmol/L）1.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，EX Taq酶（5U/μL）0.125μL，ddH2O 14.375μL，混勻后進行擴增反應。循環參數為：94℃預變性 4min，然后94℃ 15s→65℃ 30s→72℃ 15s共40個循環，最后72℃延伸10min。

1.5.5 電泳分析 將產物放在6%的瓊脂凝膠中，150V電泳20min后用凝膠成像儀觀察DNA條帶的分布并對其基因進行分型。

1.6 模擬臨床血液感染肺炎鏈球菌標本的檢測

將臨床分離獲得的非重復的7株肺炎鏈球菌純培養后，分別制成模擬臨床血液感染細菌標本并進行DNA提取，AFLP檢測，用肺炎鏈球菌ATCC49619做陽性對照。

1.7 特異性實驗

將臨床分離獲得的15株非肺炎鏈球菌（包括：銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、屎腸球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、宋內志賀菌、傷寒沙門菌、粘質沙雷菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌）純培養后分別制成模擬臨床血液感染細菌標本并進行DNA提取，AFLP檢測。同時用肺炎鏈球菌ATCC49619做陽性對照，以無菌蒸餾水做空白對照。

1.8 靈敏度實驗

將肺炎鏈球菌標準菌株純培養后，10倍梯度稀釋配制成濃度依次為3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL的菌液，與血液對倍混合，即得到系列濃度為1.5×108cfu/mL、1.5×107cfu/mL、1.5×106cfu/mL、1.5×105cfu/mL、1.5×104cfu/mL、1.5×103cfu/mL、1.5×102cfu/mL的模擬臨床血液感染肺炎鏈球菌標本，提取DNA，AFLP檢測，以無菌蒸餾水做空白對照。

2 結果

2.1 AFLP法檢測模擬臨床血液感染肺炎鏈球菌標本的結果

7個模擬臨床血液感染肺炎鏈球菌標本經AFLP 法檢測，結果均為陽性，見圖1。

2.2 特異性實驗

15個模擬臨床血液感染非肺炎鏈球菌標本經AFLP法檢測，結果均為陰性，見圖2。

6.大腸埃希菌 7.肺炎克雷伯菌 8.產氣腸桿菌 9.陰溝腸桿菌 10.宋內志賀菌 11.傷寒沙門菌 12.粘質沙雷菌 13.鮑曼不動桿菌 14.嗜麥芽窄食單胞菌 15.洋蔥伯克霍爾德菌 16.肺炎鏈球菌ATCC49619

2.3 靈敏度實驗

AFLP 方法檢測模擬臨床血液感染肺炎鏈球菌標本，可檢測到第5個稀釋度，則其檢測靈敏度為1.5×104cfu/mL，見圖3。

3 討論

肺炎鏈球菌血液感染可繼發于肺炎鏈球菌性肺炎中耳炎、乳突炎、咽炎，病菌大多由肺部經引流淋巴徑路經胸導管人血，中耳炎及乳突炎時則肺炎鏈球菌可經靜脈竇入血，肺炎鏈球菌肺炎患者中20%～30%血培養陽性，陽性率隨年齡增長而增加。脾切除患者發生較多，可能與脾臟的單核-吞噬細胞系統具有強大的吞噬與殺滅有莢膜的肺炎鏈球菌的功能有關。其他原有重癥疾病如鐮狀細胞貧血及免疫功能低下患者，均易發生肺炎鏈球菌敗血癥。

隨著肺炎鏈球菌血源性感染的逐漸增多[9]，快速鑒定及藥敏分析、指導臨床合理使用抗菌藥物是治療肺炎鏈球菌血液感染的主要途徑。然而目前，傳統細菌培養分離生化鑒定方法作為細菌診斷的金標準，檢測血液中肺炎鏈球菌，需要先進行增菌，而后采用血平板培養等，從微生物分離培養和形態學鑒定到生化分析，整個確診過程至少需3～5d；而對于臨床上肺炎鏈球菌所致血液感染，該法不能滿足要求。近年來，以PCR 技術為代表的病原核酸檢測技術得到不斷發展，如LAMP、PCR檢測16SrRNA、熒光定量PCR、熒光探針等。然而這些方法雖然可用于快速檢測，但需要特殊而昂貴的儀器才能實現，檢測費用較高，在現場使用有一定的局限性。AFLP檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步，是對各種微生物進行快速分型、鑒定及流行病學調查等研究的一種較理想的分子生物學方法[10-11]。因此我們采用該技術建立了AFLP檢測血液中肺炎鏈球菌的方法，并通過對模擬臨床血液感染細菌標本的檢測，對其特異性和靈敏度進行評價。

本研究中選擇肺炎鏈球菌的特異基因作為靶序列，設計了兩對引物，對基因組DNA進行雙酶切后鏈接，優化反應條件，選擇適宜的反應液配方，建立了AFLP檢測血液中肺炎鏈球菌的方法，并將其應用于模擬臨床血液感染細菌標本的檢測。結果表明，本研究所用7個模擬臨床血液感染肺炎鏈球菌標本用AFLP法檢測，均顯示陽性結果；而15個模擬臨床血液感染非肺炎鏈球菌（包括金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌等革蘭陽性菌，也包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌）標本，用該法檢測均未出現陽性結果，說明該法不僅可用于臨床血液中感染肺炎鏈球菌的檢測，而且結果特異，未出現假陰性和假陽性結果。此外，由靈敏度實驗結果可知，該法最低可檢測到1.5×104cfu/mL的肺炎鏈球菌，與其他PCR快速診斷檢測水平相當[3-6]；

根據上述實驗結果，我們認為所建立的AFLP檢測血液中肺炎鏈球菌的方法簡便快速、特異性好、靈敏度高，適合肺炎鏈球菌血流感染的早期診斷。

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（收稿日期：2011-09-06）