HSP60對小鼠樹突狀細胞遷移動脈粥樣斑塊的影響

[摘要] 目的 探討熱休克蛋白60（HSP60）對ApoE-/-小鼠樹突狀細胞（DC）遷移至血管動脈粥樣斑塊中的作用。方法 體外分離ApoE-/-小鼠骨髓細胞，加入rmGM-CSF和rmIL-4使之定向分化為骨髓源性DC，再分別將DC分三組與HSP60、LPS、生理鹽水（NS）孵育12h后收集DC。采用流式細胞儀檢測各組DC表面的CD80、MHCⅡ的表達率；體外應用Transwell法觀察DC遷移能力，小鼠體內腹腔注射后觀察DC向動脈粥樣斑塊遷移能力。結果 與NS組相比，HSP60組與LPS組兩組DC表面CD80、MHCⅡ表達水平升高（P＜0.05），體外遷移能力及體內遷移能力提高（P＜0.05）。結論 HSP60可以促進DC成熟、提高DC向動脈粥樣斑塊定向遷移的能力。

[關鍵詞] 熱休克蛋白60；樹突狀細胞；動脈粥樣斑塊；遷移

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2011）34-06-02

Effect of Heat Shock Protein 60 on the Migration of Murine Dendritic Cell to Atherosclerotic Plaque

ZHENG Dingyi1 ZHOU Sanjun2

1.Qiaotouhu Health Center of Ninghai County in Zhejiang Province，Ninghai 315600，China； 2.The Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310005，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of heat shock protein 60（HSP60） on the migration of dendritic cells（DCs） from apolipoprotein E（apoE）-/- mice to atherosclerotic plaque. Methods Myeloid monocytes of the mice were extracted in vitro from mouse marrow， differentiated to DC by rmGM-CSF and rmIL-4，then incubated by HSP60，LPS and NS to 12h，corresponding the variation of phenotype；CD80，MHCⅡ in DCs were detected with flow cytometric analysis；Migration ability was determined by transwell system in vitro and the migration to atherosclerotic plaque in vivo. Results Comparing with the NS-loaded DCs，expresive levels of CD80，MHCⅡ in DCs were higher in HSP60 and LPS groups（P＜0.05）；Migration abilities of DCs in vitro and in vivo were higher in HSP60 and LPS groups（P＜0.05）. Conclusion HSP60 can progress the maturation of mDCs and promote DC migration ability to atherosclerotic plaque.

[Key words] Heat shock protein 60；Dendritic cells；Atherosclerotic plaque；Migration

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發生和發展是一種慢性炎癥免疫反應密切相關的病理過程。動物實驗及臨床研究證實AS斑塊中存在多種免疫細胞，包括T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）及泡沫細胞等。DC作為已知的體內最強專職抗原提呈細胞（APC）能有效地刺激初始T細胞對異體及自身抗原產生免疫應答，在免疫反應中起著樞紐作用[1]。近來許多臨床及動物實驗證明，DC聚集在粥樣斑塊的局部且處于成熟狀態[2]。已知有多種抗原可以激活DC，如：LPS、ox-LDL、HSP60、OVA等，其中HSP60作為高度保守的物質，在許多微生物感染中存在，可以誘導DC向感染部位遷移[3]，而也有研究指出HSP60在粥樣斑塊中富集，故HSP60是否能定向誘導DC向粥樣斑塊遷移引起人們關切，因而本研究分別從體外和體內來了解HSP60對DC遷移至粥樣斑塊的能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和實驗動物

10周齡近交載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司，予以高脂飼養。HSP60購自Stressgen公司；rmGM-CSF和rmIL-4購自Biosource公司；CD80-PE、MHCⅡ-PE和CD11c+-FITC抗體購自RD公司；完全培養基包括RPMI1640（Gibco公司）、20%胎牛血清（Gibco公司）、青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL。

1.2 小鼠骨髓DC培養

依據國外文獻方案[4]，斷頸處死ApoE-/-小鼠后取長骨，去掉骨兩端，用RPMI1640培養液沖洗髓腔，收集所得液體，尼龍網過濾后溶解紅細胞，所得單核細胞懸于20%胎牛血清的RPMI1640培養液中，分離出小鼠單核細胞，含20% FCS的RPMI1640培養液中以rmGM-CSF與rmIL-4聯合刺激培養，隔天半量換液，共7d。

1.3 實驗分組

依據第7天部分培養孔中加入抗原的不同分組：HSP60組：加入HSP60，濃度為20μg/mL；LPS組：加入LPS，濃度為10μg/mL；NS組：僅加入生理鹽水。以上三組均37℃孵育12h后，PBS洗滌，離心3次。用RPMI1640重懸三組細胞，細胞密度調整為1×106 cells/mL懸液。

1.4 細胞表面標記物的監測

利用美國Becton-Dickinson公司的流式細胞儀（FASC）檢測DC表面的CD80、MHCⅡ的表達率。測定前將三組DC細胞調整密度為1×106/mL，每管為100μL，予以4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗滌兩遍，加入飽和標記抗體CD80-PE及MHCⅡ-PE，4℃冰上孵育30min，PBS洗滌兩遍。加入飽和標記抗體CD11c+-FITC后，其他同上。FASC雙標檢測DC的表型，以CD11c+設門，進行分析。

1.5 DC體外遷移實驗

依據國外文獻方法，應用Transwell模型進行研究[5]。將成熟未接觸目標抗原的DC置于上層，細胞密度標定為1×106 cells/mL，下層分別加入含有不同目標抗原的RPMI1640，具體目標抗原劑量如下：HSP60組濃度為20μg/mL；LPS組濃度為10μg/mL；NS組為對照組，不加目標抗原。系統模型運行2h后，取下中間濾膜，用蘇木精染色后在40倍顯微鏡下觀測遷移到濾膜下層面的DC數目，同時進行計數。隨機連續觀察5個高倍鏡視野，取其平均值作為DC的遷移反應結果。

1.6 DC體內遷移實驗

將三組DC細胞密度調整為1×106 cells/mL，ApoE-/-小鼠持續高脂飲食，形成動脈粥樣硬化斑塊后，皮下接種各組DC約0.2mL，每周1次，共3次。最后1次DC細胞接種3d后，予10%烏拉坦麻醉后斷頸處死小鼠，剝去主動脈，剔除血管外膜，制成冰凍切片后，予CD80-PE抗體染色后在Olympus熒光顯微鏡下觀察，隨機連續取5個視野計數斑塊中細胞。

1.7 統計學處理

使用SPSS15.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差（χ±s）表示，統計學方法采用方差分析，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞表型檢測

三組的DC用FASC分析其表型CD80及MHCⅡ。結果顯示，與NS組相比，HSP60組和LPS組的CD80及MHCⅡ表達顯著增高（t=7.14，P=0.002；t=4.29，P=0.010），但HSP60組和LPS組之間CD80及MHCⅡ表達未見差異（t=1.26，P=0.314）。見表1。

2.2 DC細胞遷移活性變化

體外遷移實驗結果顯示：與NS組相比，HSP60組和LPS組的遷移到濾膜下層面的DC數目顯著增加（t=4.02，P=0.009；t=2.95，P=0.016），但HSP60組和LPS組之間無顯著性差異（t=1.82，P=0.054）。體內遷移實驗結果顯示：與NS組相比，LPS組及HSP60組的遷移到主動脈粥樣斑塊的DC數目顯著增加（t=5.09，P=0.042；t=8.12，P=0.001），但HSP60組和LPS組之間無顯著性差異（t=1.04，P=0.088）。見表2。

3 討論

目前已經廣泛公認，動脈粥樣硬化是一種慢性免疫炎性疾病，而免疫炎性反應是動脈粥樣硬化斑塊形成的第一步，同時也是動脈粥樣斑塊破裂的重要原因之一[5]。目前認為DC作為體內最強的抗原提呈細胞，是免疫炎性反應啟動及發展的關鍵[6]。而DC存在于胸腺等免疫器官，動脈內膜理論上并不是DC的常規存在部位，故了解DC如何從免疫器官遷移至動脈粥樣斑塊局部就尤其顯得重要。

免疫細胞的遷移多以目標抗原的存在為靶向，目前認為CRP、ox-LDL、HSP60等自身抗原誘發DC成熟，其中HSP60是近來最為重視的抗原[7]。HSP60作為進化上高度保守的分子伴侶，廣泛存在于生物體內。目前認為細菌與人的HSP存在高度同源性，因而某些細菌感染后，DC細胞提呈細菌HSP65于T淋巴細胞所產生的抗體與人HSP60可能存在交叉反應，這已在多個研究中得到證實[3]。目前臨床發現動脈粥樣硬化患者體內存在HSP60抗體及HSP60特異性的T細胞[8]，說明HSP60與動脈粥樣硬化斑塊形成密切相關。因而本研究選取HSP60作為目標抗原，研究HSP60能否促使DC遷移到動脈粥樣硬化斑塊局部，啟動免疫炎癥反應。

本研究中使用的實驗動物為ApoE基因敲除小鼠，此小鼠予以高脂飲食即可形成動脈粥樣硬化斑塊，故是良好的動脈粥樣硬化斑塊動物模型。研究中通過比較HSP60、LPS和NS三種物質，發現HSP60可以上調DC的表面表型，以及體外和體內促使DC遷移，且HSP60可以定向誘導DC遷移至動脈粥樣硬化斑塊局部。這一發現為臨床更好預防冠心病發生及減少急性冠脈綜合征的發作提供了新的途徑。

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（收稿日期：2011-09-16）