萊克多巴胺殘留檢測(cè)的不確定度分析

摘 要:建立液相色譜法測(cè)定豬肝中萊克多巴胺殘留量檢測(cè)的數(shù)學(xué)模型;通過(guò)對(duì)測(cè)量過(guò)程中不確定度分量來(lái)源的分析，計(jì)算各分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度及其自由度，最后合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及其擴(kuò)展不確定度與有效自由度。

關(guān)鍵詞:不確定度評(píng)定 萊克多巴胺 高效液相色譜法 豬肝

中圖分類號(hào):TS207文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1674-098X(2011)12(b)-0090-02

數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠對(duì)分析工作而言是至關(guān)重要的，不確定度表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性，定量表示測(cè)量的準(zhǔn)確性。ISO/IEC17025－2005《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》也明確規(guī)定，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)測(cè)量結(jié)果給出不確定度評(píng)定。本文根據(jù)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合對(duì)實(shí)際操作條件的分析，對(duì)液相色譜法對(duì)豬肉中萊克多巴胺殘留量的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)估。

1 儀器、試劑與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(FLD檢測(cè)器)、離心機(jī)、pH計(jì)、梅特勒XS-104電子天平;E120H超聲波清洗器、恒溫干燥箱等;鹽酸萊克多巴胺對(duì)照品(含量:98.0±0.5%)其他試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:

精密稱取萊克多巴胺對(duì)照品約10mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制成0.1mg/ml的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1ml，2ml分別置于100ml的容量瓶中，加2%的乙酸溶液稀釋至刻度搖勻制成1μg/ml及2ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取1ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml、2ml、1ml分別置于10ml的容量瓶中，加2%的乙酸溶液稀釋至刻度搖勻制成0.5μg/ml、0.2μg/ml及0.1μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取1μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml置于100ml的容量瓶中，加2%的乙酸溶液稀釋至刻度搖勻制成0.05μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按照濃度與峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程:Y=-0.00216+0.00273X(相關(guān)系數(shù)r＝0.9999)，其中Y為濃度，X為峰面積。

1.3 樣品殘留量的測(cè)定過(guò)程

精密稱取勻漿好的豬肝樣品約5g，置于50ml的塑料離心管中加入乙腈20ml，漩渦振搖15min，于4℃的冷凍離心裝置上以3500r/min離心10min，取上清液。將上述肝樣用20ml的乙腈按照上述方法重復(fù)提取，合并上清液至分液漏斗中，用乙腈飽和的正己烷20ml振搖提取，靜置分層后除去正己烷相，重復(fù)提取3次(20ml+20ml+20ml)。乙腈相加入20mL飽和NaCl溶液，液液萃取后分離乙腈相，50℃旋轉(zhuǎn)蒸干。用2%乙酸溶液洗滌殘?jiān)?，過(guò)分別用甲醇、水、2%乙酸溶液各5mL活化的SCX固相萃取柱，用5mL的2%乙酸溶液沖洗雜質(zhì)，最后用7mL5%氨化甲醇溶液洗提。洗提液50℃N2吹干。用1mL的2%乙酸溶液重新溶解，用微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

精密量取上述供試品溶液20μl注入液相色譜儀，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算萊克多巴胺殘留量。

2 測(cè)量的不確定度來(lái)源分析

2.1 測(cè)量數(shù)學(xué)模型

樣品中萊克多巴胺的殘留量按照以下公式計(jì)算。

X= (1)

式(1)中:X為樣品中萊克多巴胺殘留量，單位為μg·g-1;C為供試品溶液中萊克多巴胺殘留量的測(cè)定值，單位為:μg/ml;V為樣品的最終定容體積;m為樣品的質(zhì)量;R為空白樣品的加樣回收率。

由公式(1)得合成的測(cè)量不確定度為:

Urel(X)=

2.2 C的不確定度評(píng)定

2.2.1 校準(zhǔn)計(jì)算引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

對(duì)于供試品溶液的濃度采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定，設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=a+bx，則供試品溶液的濃度測(cè)定的數(shù)學(xué)模型為y=a+bx，其中y為待測(cè)溶液的濃度，x為待測(cè)溶液的色譜峰面積。

該分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:Urel(X)=

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程參數(shù)的不確定度

其中，標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度=0.310，系列濃度的平均峰面積響應(yīng)=114.42。

計(jì)算得回歸曲線方程參數(shù):b=SXY/SXX=0.00273，a=Y-bX=-0.00216，s==0.00414。

s2(b)==7.024×10－10，s(b)=2.65×10－5，自由度為:V(a)=m×n-2=6×2－2＝10。

s2(a)==2.062×10－5，s(a)=0.0045，自由度為:V(b)=m×n-2=6×2－2＝10。

(2)峰面積A測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

儀器色譜峰面積積分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.0%，均勻分布屬于B類，按可靠性約20%計(jì)算其自由度為:V(A)==12

因此，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)濃度時(shí)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

Urel(X)==

=0.011

自由度

ν(X)===16.7

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液引起的不確定度

(1)對(duì)照品溶液的純度引起的不確定度:

對(duì)照品純度的不確定度為±0.5%，按正態(tài)分布置信水平為95%，純度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:U1=0.005/2=0.0025，自由度ν1=∞

(2)稱量引入的不確定度:十萬(wàn)分之一電子天平的允許誤差為±0.01mg，按照均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:0.01/=0.0058mg，稱取對(duì)照品分為兩次獨(dú)立的稱量過(guò)程:一次毛重，一次皮重，計(jì)算得天平校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:=0.0082mg。所以，稱取10.05mg對(duì)照品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:U2=0.0082/10.05=0.00082。自由度為∞

(3)稀釋過(guò)程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備引入的不確定度:100ml容量瓶引允許誤差為±0.10ml，按照均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:0.10/=0.058ml，甲醇的熱膨脹系數(shù)為1.22×10－3/℃，設(shè)溫差為5℃，則因溫度引起的體積變化為:±1.22×10－3×5×100＝±0.61ml，按均勻分布處理，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:0.61/=0.35ml。合并上述兩項(xiàng)，計(jì)算該步驟相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

/100=0.0035

②稀釋過(guò)程中引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

上述刻度為1ml、2ml、5ml的A級(jí)移液管的容量允差分別為:±0.007ml、±0.010ml、±0.015ml，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:±0.007//1=0.004、±0.010//2=0.003、±0.015//5=0.002;上述10ml、100ml單刻線容量瓶的容量允差分別為±0.020ml、±0.10ml，均按照均勻分布處理，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:±0.020//10=0.0012、±0.10//100=0.00058。水的熱膨脹系數(shù)為2.1×10－4/℃，設(shè)溫差為5℃，甲醇的膨脹系數(shù)為1.22×10－3/℃，溶劑的膨脹系數(shù)對(duì)各玻璃量器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的影響沒(méi)有差異，同時(shí)，計(jì)算應(yīng)選取最大的不確定度值，即選擇0.10ug/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

=0.0055

由上述結(jié)果可知，由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的體積相對(duì)不確定度為:

U3==0.0065

標(biāo)準(zhǔn)溶液本身的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

==0.0070，，自由度為∞

2.2.3 測(cè)試過(guò)程隨機(jī)效應(yīng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

對(duì)同一豬肝樣品重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果分別為0.973μg/ml，0.987μg/ml，0.998μg/ml，0.965μg/ml，0.982μg/ml，平均值為0.981μg/ml，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為:0.013，自由度為:n=5-1=4.

綜上可知，C相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

Urel(C)==0.018

自由度

ν(C)===13.1

2.3 定容體積引入的不確定度

樣品經(jīng)過(guò)凈化、濃縮后用2ml的移液管定容至2ml，根據(jù)檢定結(jié)果知，2ml移液管的允差為0.008ml，假設(shè)允差按照均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:0.008/=0.0046ml，2%乙酸溶液的熱膨脹系數(shù)可以近似認(rèn)為2.1×10－4/℃，按均勻分布處理，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為2.1×10－4×5×2/＝0.0012ml，所以由定容體積引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

Urel(V)==0.0024，自由度ν(V)為∞。

2.4 樣品質(zhì)量引入的不確定度

供試品的稱重在萬(wàn)分之一天平上進(jìn)行，天平的允許誤差為±0.0001g，按照均勻分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:0.0001/=0.000058mg，稱取對(duì)照品分為兩次獨(dú)立的稱量過(guò)程:一次毛重，一次皮重，所以，稱取10.05mg對(duì)照品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

Urel(M)=/5=0.000016，該項(xiàng)不確定度的自由度為∞。

2.5 回收率的不確定度

制樣過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度采用0.1ug/ml的對(duì)照品溶液1ml加入到5g空白樣品中計(jì)算加樣回收率得到。5次測(cè)量的結(jié)果分別為:70.8%，69.4%，71.4%，72.2%，66.7%，平均加樣回收率=70.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差SR=2.16%，則平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:0.0216/=0.0216/=0.97%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel(R)=0.97%/70.1%=0.014，自由度為:n=5-1=4。

可以得出，平均回收率=70.1%與100.0%的理想值(t(0.99，4)=4.60)有顯著性差異，有采用回收率對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正的必要。結(jié)果計(jì)算如下:

t==30.82

3 合成不確定度及擴(kuò)展不確定度:

相對(duì)合成不確定度==0.023

合成不確定度=0.023×0.981/5=0.0045μg/g

有效自由度為:

νeff==15.9

取置信水平為95%，包含因子為k=2，則擴(kuò)展不確定度=0.0045×2＝0.0090μg/g

參考文獻(xiàn)

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