移植途徑對大鼠骨髓間充質干細胞歸巢及肝功能恢復的影響

何秀華 李東良 江軍 徐穎 范敬靜 陳娟 陳勝平

活體肝移植是近年來發展起來的一種治療終末期肝病的新技術，為解決供肝來源的短缺開拓了新的途徑。活體肝移植的關鍵性技術之一是使移植到受體的肝組織塊以及供體剩余的肝組織能盡快再生，以滿足機體代謝所需有效的肝體積。因此，促進部分肝移植肝再生的研究也就成了近年來器官移植領域一個新的研究熱點。骨髓間充質干細胞（ mesenchymal stem cells,MSCs ），是中胚層分化而成的一種非造血成體干細胞，近年來發現其不僅具有強大的潛在自我更新能力，并且在特定條件下可以分化成脂肪細胞、成骨細胞和肝細胞等多種細胞，動物實驗亦表明 MSCs 可以修復損傷或基因突變的骨、軟骨和心肌等組織[1]。但 MSCs 促進肝再生的確切作用尚不十分明確。本研究建立肝大部切除大鼠模型，將體外培養的骨髓 MSCs 分別通過尾靜脈及門靜脈兩種途徑移植到肝臟，觀察其在肝臟的歸巢、定植及對肝再生的作用，為骨髓干細胞（ bone marrow stem cell,BMSCs ）治療肝病提供理論依據。

材料和方法

一、材料

清潔級 SD 大鼠共 36只，其中 10周齡（體重 180～220 g）31只，4周齡（體重 60～80 g）5只，均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2007-0005，飼養于南京軍區福州總醫院比較醫學中心 IVC 清潔級實驗動物飼養系統；DMEM/F12培養基及胰酶均購自美國 Gibico公司；胎牛血清購自奧地利 PAA 公司；倉鼠抗大鼠CD29-PE、小鼠抗大鼠CD45-PE、小鼠抗大鼠CD90.1-PE 均購自美國 BioLegend 公司；小鼠抗大鼠CD34-PE購自美國 Santa Cruz 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（ 4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI ）購自美國 Roche 公司。

二、大鼠骨髓 MSCs 的分離與培養

將體重 60～80 g SD 大鼠，用 10﹪ 水合氯醛按 0.3ml/100 g 劑量腹腔注射麻醉，置于75﹪酒精浸泡約 20min，頭部露于酒精液面以上，無菌條件下分離出大鼠的股骨和脛骨，用注射器沖出骨髓細胞后經 4 號針頭吹打，制成單細胞懸液，用加 10﹪ 胎牛血清 DMEM/F12 重懸細胞，接種于25 cm2的培養瓶，置于37℃，5﹪CO2飽和濕度的恒溫培養箱中培養，3 d 后首次換液，以后每2～3 d 換液 1次，7～10d 細胞生長融合，經 0.25﹪ 胰酶消化，1:2傳代，其后一般3 d 傳代 1次，選取生長良好的 P3 代細胞進行下列實驗。

三、大鼠骨髓 MSCs 的鑒定

胰酶消化 P3 代細胞，PBS 洗滌 2次，分別加入 PE 標記 CD29、CD34、CD45 和CD90 單克隆熒光抗體，同型對照，室溫避光孵育，應用流式細胞儀檢測 MSCs 的表面標志。

四、DAPI 標記 MSCs

取 P3 代 MSCs，待細胞 60﹪～70﹪ 融合時，培養液中加入終濃度為 1 μg/ml DAPI 溶液，孵育12h后用PBS洗滌至少 6次，去除未與細胞結合的 DAPI，在熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況。

五、肝大部切除模型構建

體重 180～220 g 的 SD 大鼠31只，乙醚持續吸入麻醉，仰臥位固定，于劍突下 0.5 cm 腹中線剪開約 6 cm 長切口，打開腹腔，從肝蒂處結扎并切除肝左葉、中葉約 70﹪ 肝體積。觀察創面無滲血后縫合關閉腹腔，24 h 未死亡，活力及飲食基本恢復正常的 30只肝大部切除大鼠用于實驗研究。

六、分組處理

(1) 肝切除組：9只，只行肝大部切除；(2) MSCs 尾靜脈移植組：11只，肝大部切除后24 h，乙醚適度麻醉大鼠，將1.5ml 約含1.5×106的 MSCs 懸液從大鼠尾靜脈緩慢注入；(3) MSCs 門靜脈移植組 ：10只，肝大部切除后，即將0.15ml 約含 1.5×106的 MSCs 懸液從大鼠門靜脈緩慢注入。

七、MSCs 歸巢情況觀察

取術后 9 d 肝組織制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下肝組織中 DAPI 標記的細胞計數。

八、大鼠肝功能檢測

術后第 3 天，眼眶后靜脈采血 1～2ml，經5000 r/min離心 3min 獲血清 0.5ml，全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）和血漿白蛋白（albumin，ALB）。術后第 9 天采用10﹪水合氯醛 0.3ml/100 g 麻醉后，下腔靜脈采血 1～5ml 做 ALT、AST 和ALB 檢測。

九、統計學處理

結 果

一、MSCs 的分離培養

分離培養的細胞早期呈圓形，隨后逐漸伸展，呈成纖維細胞樣，并逐漸生長排列為漩渦狀（圖1）。

二、MSCs 表面標志物測定

流式細胞儀結果顯示細胞均一性較好，CD34、CD45 的陽性率分別為 0.32﹪、0.60﹪，CD29、CD90 的陽性率分別為 98.6﹪、99.5﹪，說明傳代貼壁生長的梭形細胞為 MSCs （圖 2）。

三、大鼠術后一般情況

大鼠于術后半天內開始活動、進食和飲水。對照組 9只大鼠均存活。門靜脈移植組中 1只大鼠因門靜脈注射細胞后止血不徹底而死亡，成活 9只。尾靜脈移植組中有 2只大鼠于注射細胞后即出現呼吸困難、四肢無力而死亡，成活 9只。術后 9 d，對照組中 3只、門靜脈組和尾靜脈組中 1只出現腹部顯著膨隆，解剖發現腹腔大量清亮腹水。

圖1 大鼠骨髓MSCs

圖2 大鼠骨髓 MSCs 的表面標志物

四、MSCs 歸巢情況

MSCs移植術后第 9 天，熒光顯微鏡觀察肝組織中帶有藍色熒光的 DAPI 標記陽性的 MSCs細胞，尾靜脈移植組大鼠肝組織可見較少量的DAPI標記細胞；尾靜脈組（7.6±2.0）個細胞/100倍視野，門靜脈組（18.1±3.4）個細胞/100倍視野。兩組比較差異具有統計學意義（P < 0.01）。說明移植等量 MSCs，門靜脈移植組到肝臟定歸巢及定植的 MSCs 多于尾靜脈移植組（ 圖 3 ）。

五、大鼠肝功能變化

術后第 3 天檢測各組大鼠均出現不同程度的血清轉氨酶升高及 ALB 降低，各組之間相比均無統計學意義（P > 0.05）。術后第9天各組大鼠肝功能均有好轉， ALT 及 AST 3組之間無統計學意義（P > 0.05），但兩個移植組與單純肝切除組比較ALB均有明顯升高，差異具有統計學意義（F=6.259，P=0.006），尾靜脈移植組與門靜脈移植組兩移植組之間相比差異無統計學意義（P > 0.05，表 1）。

圖3 肝內DAPI 標記的 MSCs 免疫熒光檢查(×100)

表1 術后不同時間各組肝功能比較（）

表1 術后不同時間各組肝功能比較（）

注：與對照組相比 aP < 0.05

組別 動物數（只）3 d 9 d ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L） ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L）對照組 9 095.22±30.08 251.56± 61.94 30.22± 3.83 073.56±20.30 190.78±128.55 29.22± 5.29尾靜脈移植組 11 105.56±40.84 284.89±174.78 24.22±11.94 053.22±21.91 136.44± 57.70 35.11± 3.52a門靜脈移植組 10 150.78±86.86 402.56±162.94 27.44± 2.07 73.56±19.07 167.78± 55.10 34.11± 2.62a F 值 2.516 2.883 1.536 2.822 1.046 6.259 P 值 0.099 0.073 0.233 0.057 0.365 0.006

討 論

BMSCs 是具有自我更新、高度增生和多向分化潛能的細胞群體。BMSCs 主要包括造血干細胞（hemopoietic stem cells,HSCs）和MSCs。骨髓MSCs是骨髓基質中主要的干細胞，參與基質微環境的組成和造血功能的調控，并且可以跨越胚層橫向分化為各種組織細胞[2-6]，包括向肝樣細胞分化，具備取材方便、體外培養技術成熟、以及自體移植潛能等優點，可為組織損傷和疾病治療提供一種理想的“種子”細胞。因此成為近年來再生醫學和組織工程研究的熱點之一。

內環境和肝臟本身微環境是促進骨髓 MSCs 向肝樣細胞轉化的關鍵因素，分化的肝樣細胞能夠對損傷的肝臟起到一定的修復作用。Arikura 等[7]將先天性白蛋白缺乏癥大鼠肝臟做70﹪切除后，立即通過門靜脈植入正常大鼠骨髓 MSCs，4周后在受體肝臟檢測到白蛋白陽性并表達白蛋白 mRNA 的肝細胞，血清中也檢測到白蛋白。Abdel Azizet 等[8]將雄性大鼠骨髓中 CD29+MSCs 通過尾靜脈移植入肝纖維化模型雌性大鼠體內，研究結果提示MSCs在體內可以分化為肝樣細胞，并通過減少膠原沉積來發揮其抗纖維化作用。這些研究為 MSCs 治療肝病提供了理論依據。但也有相反的研究報道，例如在 Cantz 等[9]的研究中沒有發現骨髓 MSCs 向肝細胞分化，并促進其再生作用。包括 MSCs 在內的干細胞治療肝臟疾病還有許多問題需要研究和探討。

本實驗建立肝大部切除大鼠模型，通過尾靜脈和門靜脈兩種不同途徑輸注DAPI標記的MSCs，主要觀察DAPI陽性MSCs在肝臟的歸巢、定植和對肝功能恢復的影響。結果移植等量MSCs，門靜脈移植組到肝臟歸巢及定植的MSCs多于尾靜脈移植組，移植途徑對MSCs歸巢、定植到肝臟有一定影響；另外，移植組肝臟合成白蛋白功能恢復的較快，提示MSCs具有促進肝細胞再生的能力。但是，兩種移植途徑相比在肝功能改善方面并沒有顯示出明顯差異，其原因和機制值得進一步研究和探討，推測可能與觀察時間較短有一定關系，但也不排除MSCs只起到一個刺激肝細胞或肝卵圓細胞活化的作用，因此肝臟合成能力的改善與歸巢定植到肝臟的MSCs數量不一致。一般認為肝部分切除后的肝再生主要由肝細胞再生完成，只有在大部分肝細胞死亡或肝毒性物質持續作用時，卵圓細胞才快速增殖，參與肝再生[10-11]。骨髓細胞向肝細胞轉化僅在嚴重急性肝損傷的情況下發生，如卵圓細胞死亡時，BMSCs或定居于骨髓的肝干細胞迅速發生遷移，在肝臟中增殖分化為肝細胞[12]。MSCs在肝大部切除術后是否也有促進肝再生的作用尚不明確，本研究結果提示骨髓MSCs具有促進肝大部切除大鼠肝再生的作用。這為活體部分肝移植術后迅速促進肝再生，防治小肝綜合征的發生提供了一條新的思路，值得進一步深入研究。

1 何秀華,李東良.骨髓干細胞治療肝病研究進展[J].國際消化病雜志,2010,30(3):129-131.

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3 Tokcaer-Keskin Z,Akar AR,Ayaloglu-Butun F,et al.Timing of induction of cardiomyocyte differentiation for in vitro cultured mesenchymal stem cells: a perspective for emergencies[J].Can J Physiol Pharmacol,2009,87(2):143-150.

4 Liu JW,Dunoyer-Geindre S,Serre-Beinier V,et al.Characterization of endothelial-like cells derived from human mesenchymal stem cells[J].J Thromb Haemost,2007,5(4):826-834.

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7 Arikura J,Inagaki M,Huiling X,et al.Colonizationof albumin-produsing hepatocytes derived from transplanted F344 rat bone marrow cells in the live of congenic Nagase’ s anabuminemic rats[J].J Hepatol,2004,41(2):215-221.

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10 Katoonizadeh A,Nevens F,Verslype C,et al.Liver regeneration in acute severe liver impairment: a clinicopathological correlation study[J].Liver Int,2006,26(10):1225-1233.

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