供體胰腺保存方法的改進

董維平 蔡錦全 譚建明 王煜非 王鑒波 彭永德

糖尿病是嚴重危害人類健康的三大主要疾病之一，外源性胰島素替代療法雖能延緩糖尿病的發展，延長患者的生存期，但不能阻止糖尿病并發癥的發生和發展，胰島細胞移植是一種替代胰腺內分泌功能的生理途徑[1]。目前胰島分離技術尚不成熟，往往需要2個或以上同血型的胰腺才能分離出1次移植所需要的胰島數量[2]，因而造成供體胰腺的嚴重緊缺。目前的供胰來源常為多器官捐獻者，在摘取其他器官時難免會傷及胰腺，由于胰腺組織一旦破損，受損的腺泡細胞會釋放胰蛋白酶原及其他消化酶原，對胰島有明顯的破壞作用，這更加劇了供體不足的矛盾。因此，我們嘗試在胰腺保存液中添加胰蛋白酶抑制劑，預防胰蛋白酶對胰島的破壞作用，使破損的胰腺也能用于分離胰島，從而擴大供胰的來源，提高供體胰腺的質量。

材料與方法

一、材料

（一）胰腺來源

經我院倫理委員會批準、自愿捐獻的成人尸體胰腺。

（二）試劑

組織分散酶(Liberase HI,瑞士Roche公司)，胰蛋白酶抑制劑(烏司他丁,瑞士Roche公司)，威斯康辛大學保存液(UW液,美國Bristol-Myers Squibb公司)，全氟萘烷(PFC,美國FluoroMed公司)，雙硫腙（DTZ,Sigma公司)，丫啶橙(AO，Sigma公司)，碘丙啶(PI,Sigma公司)，胰島素檢測ELISA試劑盒（DSL公司）。

二、方法

（一）供胰摘取及運送

采用腹部大十字切口，開腹后先從腹主動脈下段插入雙腔氣囊導尿管，插至腹腔動脈上方充氣阻斷胸主動脈，4℃離體腎保存液( HC-A液)灌注，然后從腸系膜上靜脈插管，4℃ HC-A液灌注。開始灌注后迅速從下腔靜脈放血，并剪開胸腔阻斷肝上下腔靜脈。HC-A 液快速灌注排去肝、胰、腎和十二指腸內血液后改為4℃UW 液灌注，同時用無菌鹽水碎冰塊置于腹腔內加速降溫。灌注UW液后迅速將肝、脾、十二指腸和雙腎整塊切取。胰腺摘取后置4℃UW/PFC雙層保養液，于冰浴中保存運輸。根據胰腺的情況，分為：對照組（連十二指腸一起摘?。?、完整組（原位分離十二指腸和結扎胰管后摘?。┖推茡p組（切除部分胰頭組織后摘取胰腺）。完整組與破損組的UW保養液中添加烏司他丁。

（二）胰腺鑒定

取出胰腺后，取保存胰腺的UW液檢測淀粉酶濃度，以檢驗胰腺受損程度。

（三）胰島分離純化、計數及活率鑒定

胰島細胞的分離純化按我們以前報道的方法進行[3]，純化后用含1﹪（V / V ）人血清白蛋白的RPMI 1640離心洗滌2次，取樣DTZ染色后進行胰島計數，并按公式換算為相當于直徑150 μm的胰島當量（islets equivalent quantity,IEQ） ；AO / PI雙色熒光染色，鑒定胰島的活率[4]。

（四）胰島功能檢測

純化、洗滌后的胰島用含1﹪人血清白蛋白的1066培養液，37℃，95﹪空氣，5﹪CO2培養過夜，收集后用無糖1640培養液洗2次，均分于3支離心管中，離心半徑17cm，1000 r/min離心1min后棄上清，加含1﹪人血清白蛋白的低糖1640培養液（2.8mmol/L葡萄糖），37℃培養2h，換1﹪人血清白蛋白的高糖1640培養液（含16.7mmol/L葡萄糖），37℃培養2h，收集培養液測胰島素含量，計算釋放指數（高糖胰島素含量/低糖胰島素含量），取3管的均數。

三、統計學處理

應用SPSS 10.5進行統計學處理，淀粉酶含量和胰島消化分離結果指標及胰島功能和活力指標以表示，著性檢驗采用完全隨機的F 檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、烏司他丁對胰腺的保護作用

保存胰腺的UW液中淀粉酶的含量各組間比較差異無統計學意義(表1)。

二、胰島得率、純度和活率

胰腺經Liberase HI消化分離，胰島純化后，各組的胰島得率、純度和活率的差異均無統計學意義(表1)。

三、胰島功能和活力檢測

各組的低糖、高糖胰島素含量和釋放指數差異均無統計學意義(表2)。

表1 各組淀粉酶含量和胰島消化分離結果的比較( )

表1 各組淀粉酶含量和胰島消化分離結果的比較( )

組別 例數 淀粉酶含量（U） 胰島得率( IEQ / 胰腺 ) 胰島純度(﹪) 胰島活率(﹪)對照組 12 31±21 319921±98496 66.9±27.7 95.8±1.14完整組 8 37±22 327095±121698 69.7±22.8 95.8±1.04破損組 6 44±16 295104±76505 68.5±20.8 95.8±1.17 F 值 0.835 0.182 0.031 0.000 P 值 0.446 0.835 0.969 0.954

表2 各組胰島功能和活力比較( )

表2 各組胰島功能和活力比較( )

組別 例數 胰島素含量( pmol/100 IEQ ) 釋放指數低糖 高糖對照組 12 149±66 387±186 2.98±1.70完整組 8 140±54 389±130 3.10±1.40破損組 6 137±31 394±128 2.85±0.48 F 值 0.112 0.013 0.053 P 值 0.894 0.987 0.948

討 論

消化液的充分灌注是胰島分離成功的一個關鍵因素[5]。因此，必須保證灌注前胰腺的完整。最近的證據已經證實，胰島得率的不一致，與尸體胰內生酶的激活有關[6]，大量研究證明內生胰酶的釋放對胰島起傷害作用[7-11]。Krause等[12]的實驗亦證明胰蛋白酶有損壞胰島膜的作用，由于胰島散在分布于胰腺的腺泡實質中，僅占整個胰腺的1﹪～2﹪，在分離和摘取胰腺過程中，如果傷及胰腺就會引起腺泡細胞的破壞，胰蛋白酶原及其它消化酶原自破壞的腺泡細胞中釋放出來。胰蛋白酶原具有激活自身的能力，使胰蛋白酶原轉變為有活性的胰蛋白酶，胰蛋白酶又可以迅速地激活其它的胰蛋白酶原和其他的許多酶原，引起一系列酶促反應的“爆發”。胰蛋白酶除直接對胰島組織有破壞作用外，還可以激活磷脂酶A2，將卵磷脂和腦磷脂轉變為具有很強的細胞毒作用的溶血卵磷脂和溶血腦磷脂，使細胞和組織發生壞死。因此，為了保持胰腺的完整和防止因腺泡細胞破壞導致的內生胰酶釋放，目前進行胰島分離的胰腺都采用帶十二指腸摘取。由于供體胰腺大多來源于多器官供體的尸體，帶十二指腸取胰必須剪斷腸管，極易造成供體器官的污染。在分離和摘取其它器官時，也難免碰傷胰腺組織，造成供體器官的浪費。如果在胰島的分離前加入胰蛋白酶抑制劑，防止受損胰腺胰蛋白酶和磷脂酶被過早過量激活，可大大提高胰腺的質量和利用率。由于添加了胰蛋白酶抑制劑，保存液中檢測胰蛋白酶濃度的意義不大。因此，我們用保存液中的淀粉酶濃度來比較各組胰腺的受損程度。

烏司他丁主要通過與胰蛋白酶分子結合后使胰蛋白酶失活，從而抑制已激活的胰蛋白酶的活性，并進而避免大量胰蛋白酶原及其他一些消化酶原被過早激活；該藥還能同時獨立抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、透明質酸酶、纖溶酶、彈性蛋白酶和羧基肽酶等多種酶的活性，并具有穩定溶酶體膜的功能，從而抑制溶酶體酶的釋放，這是防止胰島組織被裂解破壞的重要保護措施之一。在UW-PFC雙層保存方法（two-layer method,TLM）的基礎上，在UW液中添加烏司他丁抑制胰蛋白酶的活性，用以保存破損的胰腺。對照組和破損組的各項指標對比，結果對照組、完整組和破損組的UW液中淀粉酶含量的差異比較均沒有統計學意義；胰腺消化分離的胰島得率、純度和功能與對照組比較亦無統計學意義的差異。表明烏司他丁能有效的抑制受損胰腺釋放出的胰蛋白酶，對供體胰腺起到了保護的作用（表1）。

本組資料應用烏司他丁的完整組、破損組與對照組比較，胰島素釋放試驗的低糖、高糖和釋放指數的差異都沒有統計學意義，表明烏司他丁對胰島的功能沒有影響。在目前的研究中Pefabloc [4- (2-氨基乙烷)氟氫氯酸苯] 、STI (大豆胰蛋白酶抑制劑) 等具有抑制胰蛋白酶功能的制劑被應用于胰島提取中。但Lu等[13]研究數據顯示，STI對新鮮或經低溫保存的大鼠胰腺的胰島得率沒有影響。Pefabloc 被認為是一種有效的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以減弱胰蛋白酶的活性，保護胰島細胞[7,14]。Matsumoto等[15]在雙層保存液中添加 Pefabloc后，延長了胰腺的保存時間和改進了胰島活力的恢復。但 Pefabloc 是一種不可逆性的胰蛋白酶抑制劑，至今仍只在實驗研究中應用，目前還沒有實驗證明可用于臨床。烏司他丁作為一種成品藥已應用于臨床，因此有理由相信此方法為一種更為有效的胰腺保存方法。

本組資料結果表明，烏司他丁能有效的抑制低溫保存的成人胰腺內生酶的激活，且對胰島的功能沒有影響。Goto等[16]應用顏料溶液（Metyltioninklorid）和組織膠水（Indermil）檢測和修補漏洞，使破損胰腺也能用于分離胰島。如果在此基礎上，應用我們改進的胰腺保存方法，將大大提高供體胰腺的利用率。因此，在雙層保存液中添加烏司他丁：（1）使受損胰腺也能用于分離胰島，增加了供胰的來源；（2）可分離十二指腸后取胰，減少供體器官被污染的機會；（3）作為已在臨床使用的蛋白酶抑制劑，比Pefabloc更適用于供體胰腺的保存。

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