黃芪甲苷促進心肌干細胞分化的作用研究

廖聯明 鄭友生 江敏 趙素萍

隨著人們生活水平的提高，心腦血管疾病成為城鄉居民死亡的第一殺手。根據衛生部公布的《2010中國衛生統計年鑒》，我國城市每十萬人中已經有235人死于心腦血管疾病。急性心肌梗死是心血管疾病中的一個非常嚴重的類型，患者部分心肌因嚴重而持久的缺血發生局部壞死，從而導致心臟功能的嚴重損害。以往認為心肌梗死是一個不可逆的損傷，無論什么方法均不能使心肌疤痕組織重新變成有收縮功能的心肌組織。此外對于終末期的心功能不全患者，心臟移植是挽救他們生命的唯一辦法。由于心臟來源的有限和其昂貴的費用，只有少數患者有機會接受心臟移植治療。因此迫切需要建立其他有效的療法。

最近10年干細胞技術的發展使細胞治療在心臟病中的應用達到了一個新的高潮。短短的幾年心肌梗死的骨髓源干細胞治療即從動物試驗過渡到了臨床[1-3]。但移植的骨髓源干細胞分化而成的心肌細胞和受者的心肌細胞的電生理特性不完全一樣，可能產生心率失常。近年的研究認為，在心肌中存在心肌干細胞，在急性心肌梗死和慢性心衰患者的心肌可檢測到被激活的心肌干細胞[2-7]。由于心肌干細胞的激活程度不高，不能對受損的心肌進行有效的修復，因此如何通過小分子藥物激活患者的心肌干細胞，讓他們充分增殖和分化，是心肌干細胞研究的重點之一。本研究采用免疫磁珠的方法分離Sca-1+心肌干細胞，并探索黃芪甲苷對其分化的影響。

材料和方法

一、試驗動物和試劑

6～12周齡的昆明種小鼠購自福建醫科大學吳氏實驗動物中心。黃芪甲苷購自中國藥品生物制品檢定所。膠原酶購自Sigma公司。抗生物素抗體磁珠為德國Miltenyi Biotec公司產品。其他試劑購自武漢博士德生物技術有限公司，化學試劑為分析純。

二、Sca-1+心肌干細胞的分選

[8]報道的方法，將6～12周齡的C57BL/6小鼠心臟取出后以0.025﹪的膠原酶灌注，剪碎心肌，以0.1﹪的膠原酶37℃ 消化30min。這種消化過程對成熟的心肌細胞是致死性的。消化后的細胞過70 μm的篩網后以Sca-1抗體-生物素復合物標記，再以抗生物素抗體磁珠分選2次。分選的細胞以DMEM 培養基繼續培養。DMEM 培養基含10﹪小牛血清、100 U/ml 青霉素 G、100μg/ml鏈霉素、2mmol L-谷氨酰胺、25mmol HEPES、10 ng/ml EGF和10 ng/ml SCF。

三、心肌干細胞的分化誘導

按參考文獻[8]報道的方法，將心肌干細胞以5×103/ml的密度接種于放置有消毒蓋玻片的6孔板內，制備細胞爬片。每孔加入2ml DMEM-M199 (4:1)培養基，內含10﹪馬血清、5﹪FBS、青霉素 (100 U/ml)、鏈霉素 (100μg/ml) ；2mmol/L L-glutamine 和黃芪甲苷 ( 終末濃度為20和200mg/L)。對照組只加培養液。72h后吸出培養基，小心加入磷酸緩沖液輕輕沖洗2次后，再加入4﹪多聚甲醛/磷酸緩沖液室溫固定15～20min。參照EliVision Plus試劑盒說明書進行免疫細胞化學染色，檢測特異性心肌細胞標志蛋白desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT。顯色劑為二胺基聯苯胺（diaminobenzidine,DAB），陽性顯色為棕色，以未誘導細胞作對照。

結 果

一、心肌干細胞的分離

根據文獻[8]報道的方法進行分選。心肌細胞分選前6.1﹪表達Sca-1。經磁珠分選后的細胞，流式細胞儀檢測的結果顯示93.2﹪表達Sca-1（圖1）。此外，細胞不表達造血干細胞標志CD34和白細胞標志CD45。CD31也不表達。

二、心肌干細胞的分化潛能

終末濃度為 250mg/L的黃芪甲苷誘導4周的干細胞呈多邊形，有偽足，偽足可相互接觸。免疫組化染色顯示細胞表達desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT。而未誘導的細胞和20mg/L的黃芪甲苷誘導的細胞desmin、α-sarcomeric actin和C-TnT 均為陰性。說明黃芪甲苷有促進心肌干細胞分化為心肌細胞的潛能(圖2 )。

圖1 心肌干細胞的表型測定

圖2 黃芪甲甙對心肌干細胞分化的影響

討 論

在哺乳動物的成長過程中，心臟的擴大既依賴于心肌細胞的增殖，同時伴隨細胞體積的增大。在成長的初期主要依賴心肌細胞的增殖，然后逐步過渡到依賴于細胞體積的增大，在成年期以后一般認為心肌細胞就不太增殖了。這種觀點的產生主要基于以下事實：一方面心臟損傷后其功能很難有明顯的恢復，也未觀察到心肌細胞的再生；另一方面，在成人原發性的心臟腫瘤幾乎沒有。

雖然這些事實表明心肌細胞幾乎沒有再生能力，但并不能排除心肌細胞有一定的再生能力。1977 年 Rumyantsev等[9]曾經指出在成年哺乳動物的心室肌存在有限的細胞可合成DNA，進入細胞分裂周期。他還指出在心房及冷血動物的心臟，心肌細胞的分裂能力更大。Beltrami等[4-5]推測在慢性心臟衰竭的長時間的負荷下，心肌細胞可能已經在經歷了有限的分裂后慢慢失去了再生能力。因此他們采用急性心肌梗死后的心臟進行研究。在發作心臟病7～17 h后死亡的13例患者中，他們發現，受損傷部位的心肌細胞會在一定程度上重新分裂、增殖許多天，離損傷部位較遠的少數心肌細胞同樣會分裂、增殖。這項研究成果更新了心肌不能再生的傳統觀點。他們將這13例患者的心臟與死于其他原因的另10例患者的心臟對照后發現：死于心臟病發作的13例患者的梗死心肌邊緣部位，細胞分裂是死于其他原因的10例患者的84倍；較遠的心肌組織細胞分裂，前13例患者是后10例患者的28倍左右。

2003 年 Oh 等[6]進行了心肌細胞的首次分離。他們首先將6～12周齡的 C57BL/6 小鼠心臟取出后以 0.025﹪ 的膠原酶灌注，以0.1﹪的膠原酶消化。消化后的細胞過采用磁珠法分離出的Sca-1+心肌。心肌干細胞在5-氮胞苷的作用下，細胞表達肌節α-肌動蛋白和肌鈣蛋白 -I。

1995年Wakitani等[10]發現5-氮胞苷可以將骨髓間充質細胞誘導成為骨骼肌細胞。此后Konieczny和Emerson[11]發現5-氮胞苷也可誘導小鼠胚胎細胞系向心肌細胞分化，并證實這類細胞含有肌細胞源性決定族，在甲基化狀態呈現轉錄失活，而在5-氮胞苷作用下，即去甲基狀態下，肌細胞決定族轉錄激活，從而使該類細胞分化為心肌細胞。5-氮胞苷的這種作用在誘導心肌干細胞向心肌細胞分化試驗中也得到證實[6,8]。5-氮胞苷作為抗腫瘤藥物具有一定的毒副作用，因此有必要尋找更安全有效的誘導劑。

中藥在治療心肌梗死方面的作用已經得到證實。本研究有理由相信中藥中的一些小分子化合物可能通過不同的途徑抑制細胞的凋亡，促進細胞的增殖，從而發揮中藥的療效。冼紹祥等[12]通過篩選發現中藥單體黃芪甲苷可誘導間充質干細胞分化成心肌樣細胞。此外陳嘉等[13]報道丹酚酸B能誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化。根據他們的研究結果，本研究采用黃芪甲苷誘導心肌干細胞，也發現具有很好的誘導作用。

心肌干細胞的潛在應用價值還未被完全開發之前，有許多問題需要回答，尤其是其分化為心肌細胞的機制。進行中藥誘導心肌干細胞分化為心肌細胞的探索，將為應用中醫藥治療心肌梗死提供新的理論依據。此外中藥有可能與細胞移植的方法相結合治心肌梗死，有廣闊的應用前景。

參考文獻

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