人類白細胞抗原半相合供者外周血細胞因子誘導的殺傷細胞治療晚期原發性肝癌二例

葉扶光 許怡薇 姚尚志 張鑫 肖漓 馬錫慧 高鈺 馮凱 石炳毅

細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer cells,CIK）是一種新型免疫活性細胞。其兼有 T 細胞抗瘤活性和自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)非主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)限性殺瘤的特點，殺傷活性可達 84.7﹪[1]。與淋巴因子激活的殺傷細胞（ lymphokine-activated killer,LAK ）和腫瘤浸潤淋巴細胞（ tumor infiltrating lymphocyte,TIL ）相比，CIK 具增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣和毒副作用小等優點[2]。實驗證實，同正常人的 CIK 相比，肝癌患者 CIK 的增殖速度較慢且增殖倍數也有所降低[3]。晚期肝癌患者耐受力差，且患者自體淋巴細胞往往存在嚴重的免疫抑制，直接影響自體過繼性免疫治療的效果。所以我們為2例晚期肝癌患者回輸取自人類白細胞抗原( human leucocyte antigen,HLA )配型半相合直系親屬健康供者的單個核細胞所培養獲得CIK細胞，回輸于患者用于其肝癌治療。現就其近期療效報道如下。

資料與方法

一、病例選擇

于2010年7月至2010年9月于解放軍第三〇九醫院器官移植中心細胞治療科診治的2例肝癌患者。診斷符合 1999 年第 4 屆全國肝癌學術會議通過的原發性肝癌診斷標準診斷，且CIK細胞治療與其他治療間隔4周以上。

患者1：男性 33 歲，經影像學、細胞學及病理學檢查確診，在行CIK治療前行3次介入栓塞化療，1次全身化療，治療無明顯效果。患者肝臟彌漫性占位病變，門靜脈主干及其分支癌栓形成、海綿狀門脈，兩肺多發轉移，脾大，肝硬化。

患者2：男性 48 歲，經影像學、細胞學及病理學檢查確診，在行 CIK 治療前行3次介入栓塞化療，手術1次。肝癌根除術后復發，患者肝多發占位，肝硬化，腹水，脾大，黃疸。

二、供者選擇

患者1供者為其親生父親，患者2供者為其親生女，兩供者均經HLA配型證實與受者HLA配型為半相合

三、CIK 細胞制備

采用費森尤斯細胞分離機循環5000ml之后的健康供者 PBMC 用 Ficoll 分離并收集單個核細胞，用 RPM I -1640洗滌 3次，按 2×106/ml 懸浮于RPM I-1640完全培養基中。參照美國斯坦福大學骨髓移植中心建立的 CIK 細胞培養方法：第0天加入IFN-γ 500 U/ml，置于37 ℃，5﹪CO2培養箱中培養24 h，第1天加入IL-2300 U/ml，CD310 μg/L，IL-1100 U/ml繼續培養，每天觀察細胞生長并根據情況進行擴增。以后每 3 d換液 1次并調整細胞數為（1～2）×109/L，在37℃，5﹪ CO2培養箱中連續培養10～12 d后計數。CIK 細胞培養14～28 d后，取少量培養細胞做免疫組化檢測，當 CD3+、CD56+細胞數≥65﹪，CD3+、CD8+細胞≥35﹪，且微生物學檢查陰性時收集細胞。

四、CIK 免疫表型檢測

在 CIK 培養的第 0 天和第 14 天分別抽取少量細胞，用流式細胞儀行免疫表型分析，查 CD3+/CD56+及 CD3+/CD8+細胞比例。

五、CIK 細胞回輸

分 3次回輸于患者，每次間隔1d，一次回輸量為 1×109～1.5×1010。回輸同一天開始靜脈輸注IL-2200萬U，連續14 d。

六、療效觀察

分別檢測患者治療前后的臨床癥狀變化；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,ASP)變化；卡氏評分改變；甲胎蛋白（Alphafetoprotein，AFP）及CA199的改變。

七、毒副作用觀察

觀察患者是否有發熱、寒戰和血壓降低等。

結 果

一、CIK免疫表型

第0天2例供者CD3+、CD56+細胞分別約占3.4﹪及 5.1﹪，CD3+、CD8+細胞約占 23.2﹪及28.8﹪；第14天 CD3+、CD56+細胞約占 10.4﹪及23.4﹪，CD3+、CD8+細胞約占 47.2﹪及 80.5﹪。

二、療效觀察

2例患者接受 CIK 治療后食欲、體力均較前有好轉，體重增加，肝區疼痛減輕，腹腔積液減少，黃疸減輕。復查 CT 腫瘤均有不同程度縮小，較治療前卡氏評分提高分別提高15分和20分，腫瘤標志物及肝功能變化見表1。

表1 CIK 細胞治療前后腫瘤標志物及肝功變化

三、毒副反應

患者1第一次輸注 CIK 細胞后曾出現一過性發熱，給予對癥退熱后好轉。后 2次輸注過程順利，在不服用退熱藥情況下2h后體溫恢復正常。患者 2 在輸注 CIK 細胞后出現呼吸困難，高熱，血壓降低至 90/60 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），考慮為急性過敏反應引起，給予地塞米松治療后癥狀逐漸緩解。

討 論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率上升速度僅次于肺癌。原發性肝癌和繼發性肝癌手術切除率只為15﹪～30﹪，目前治療肝癌手段主要是手術、化療及放療，肝移植也是目前常用的方法，但供體有限，且僅限于早期肝癌。以上方法均難以長期改變患者的生存質量。過繼免疫療法具有一定的抗腫瘤效果，免疫活性細胞在體內能直接殺傷腫瘤細胞，且能調節和增強機體的免疫功能。因此，過繼免疫療法已成為腫瘤治療的輔助手段之一，為預防腫瘤復發、消除患者體內殘留的腫瘤細胞和改善晚期腫瘤患者的生存質量提供了新的治療途徑[4]。

進展期的惡性腫瘤誘導機體產生明顯的免疫耐受現象，患者自體淋巴細胞往往存在嚴重的免疫抑制[5]，直接影響自體過繼性免疫治療的效果。但是，如果 CIK 細胞來源于異基因健康供者效果較好，因為半相合的淋巴細胞可以識別受者腫瘤抗原及其 MHCⅠ/Ⅱ類分子，所以異體免疫細胞具有較晚期腫瘤患者自體細胞強得多的抗腫瘤活性。其中，供者的 T 細胞是誘導疾病緩解的最重要的免疫細胞[6-11]。

韓穎等[12]曾報道 HLA 半相合供者外周血活化干細胞治療晚期實體瘤 42例，取得了很好的效果，存在的問題是 GVL 效應需要移植術后4～6個月才會發生，存在一定的局限性。本研究通過 HLA 配型確定供受者半相合后，采集健康供者外周血單個核細胞送實驗室培養 CIK 細胞，再分 3次回輸，一方面可以保留異基因 CIK 細胞抗腫瘤的強大活力，另一方面，大量的活化免疫細胞直接進入患者體內可以直接殺傷腫瘤細胞，從而為晚期肝癌患者爭取寶貴的治療時間，同時副反應與傳統的自體 CIK 細胞也無明顯差別。2例患者均可耐受，未出現大的副作用及并發癥，患者治療后AFP，臨床癥狀比治療前有明顯改善，卡氏評分有顯著提高,治療效果較明顯。晚期肝癌患者耐受力差，已經失去了手術機會，對于化療也可能因為身體原因無法耐受。但細胞治療反應溫和，安全有效，可改善患者臨床癥狀，提高生活治療。但目前病例數較少，在未來的研究中將增加更多病例以論證其可行性。。

1 Wang F S,Liu M X,Zhang B,et al.Antitumor activites of human autologous cytokine - induced killer (CIK) cells against hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo[J].World J Gastroenterol,2002,8(3):464- 468.

2 Kaneko T,Fusauch Y,Kakui Ye,et al.Cytotoxicity of cytokine induced killer cells coated with bispecific antibodya gainst acute myeloid leukemia cells[J].Leukemia & Lymphoma,1994,14(3-4):219-229.

3 杜清友,劉明旭,王福生,等.CIK細胞體內外抗肝癌細胞作用[J].中國癌癥雜志,2001,11(4):325-327、330.

4 Hoffman DM,Gitlitz BJ,Belldegrun A,et al.Adoptive cellular therapy[J].Semin Oncol,2000,27(2):221- 233.

5 Ruggeri L,Mancusi A,2 Burchielli E,et al.NK cell alloreactivity and allogeneic hematopoietic stem cell transplantation[J].Blood CellsMol Di s,2008,40 (1):84-90

6 Mavoungou E,Sall A,Poaty-Mavoungou V,et al.Alloreactivity and association of human natural killer cells with the major his to compatibility complex[J].Clin Diagn Lab Immunolo,1999,6(2):254-259.

7 Van der Harst D,Goulmy E,Falkenburg JH,et al.Recognition ofminor histo-compatibility antigens on lymphocytic and myeloid leukemic cells by cytotoxic T-cell clones[J].Blood,1994,83(4):1060-1066.

8 Appelbaum FR.Haematopoietic cell transplantation as immuno therapy[J].Nature,2001,411(2):385-389.

9 Truitt RL,Atasoylu AA.Contribution of CD4+and CD8+T cells to graft-versus-host disease and graft-versusleukemia reactivity after transplantation of MHC compatible bone marrow[J].Bone Marrow Transplant,1991,8(1):51-58.

10 Lewalle P,Hensel N,Guimaraes A,et al.Helper and cytotoxic lymphocyte responses to chronic myeloid leukemia:implications for adoptive immunotherapy with T cells[J].Br J Haematol,1996,92(3):587-594.

11 Faber LM,van Luxemburg Heijs SA,Rijnbeek M,et al.Generation of leukemia reactive cytotoxic T lymphocyte clones from the HLA identical bonemar-donor of a patient with leukemia[J].J Exp Med,1996,176(5):1283-1289.

12 韓穎,于津浦,李慧,等.HLA半相合外周血活化干細胞治療晚期實體瘤的療效[J].中國腫瘤生物治療雜志,2010,17(1):7-12.