異常行為量表評估干細胞治療兒童孤獨癥的臨床療效及效度評價

郇英，佳那提·秋瓦西，張雋，劉敏，呂涌濤，陳興旺，郭明輝，羅朝霞，鄭潔靜，胡祥，葉圣勤，姜舒

兒童孤獨癥（autism）屬于自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）中的一種，起病于嬰幼兒期，是一種廣泛性發育障礙，主要表現為語言交流障礙、社會交往障礙和古怪、刻板行為。美國兒童自閉癥譜系障礙發病率約為1/110，其中男女患病率分別為1/70和1/315[1]。兒童孤獨癥的發病原因尚不明確，近年研究表明可能與基因、生物、環境以及其他疾病等多種因素有關。對于孤獨癥兒童患者的治療，目前臨床應用行為干預、特殊教育訓練、家庭治療計劃為主，輔以藥物療法，雖然取得了一定療效，但尚未達到理想的效果[2]。生物技術領域取得的成果吸引了越來越多的研究者和臨床醫生，其中干細胞治療的研究為兒童孤獨癥治療提供了新的思路。血流灌注不足造成大腦缺氧及免疫功能異常是孤獨癥的重要病理學基礎，而干細胞可以改善病變局部的血流灌注并可以調節異常的免疫功能，我們應用臍血單核細胞（cord blood mononuclear cells，CBMNCs）及臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）聯合康復訓練治療兒童孤獨癥，取得較好療效。

1 對象和方法

1.1 研究對象

1.1.1 選擇標準

⑴入選標準：所有研究對象年齡在3～12 歲，性別不限；由精神科專科醫師診斷符合 DSM-IV兒童孤獨癥診斷標準，兒童孤獨癥評定量表（childhood autism rating scale，CARS）評分 ≥30 分，且父母或其法定監護人同意并簽署《知情同意書》。

⑵排除標準：主要包括對血清制品過敏或敏感體質，精神障礙患者，Asperger 綜合征，Rett 綜合征或未分類的帕金森病癡呆（PDD）患者，近 6個月內有癲癇發作史者，因活動性癲癇、腦血管疾病或腦外傷等原因造成的孤獨癥患者，中度或重度錐體外系癥狀或遲發性運動障礙者，具有明顯自傷行為以及合并其他嚴重疾病的患者。

1.1.2 對象分組 選取 2009年3 月–2009年9 月在山東省交通醫院住院行干細胞治療的兒童孤獨癥患者 23 例，分為臍血組和混合組，分別為14 與9 例，其中臍血組男 13 例，女 1 例，年齡跨度 3.29～12.02 歲，平均年齡（7.41±2.63）歲；混合組男 9 例，女 0 例，年齡跨度 3.98～9.83 歲，平均年齡（6.20±2.12）歲。另選取在濟南明天兒童康復中心行康復訓練治療的兒童孤獨癥患者 14 例（脫落 1 例）為對照組，其中男14 例，女 0 例，年齡跨度 3.51～10.02 歲，平均年齡（5.60±2.01）歲。三組受試者在年齡、性別組成、身高、體重、病情輕重程度以及家族遺傳史及母孕情況上差異均無統計學意義，具有可比性。

1.2 干細胞來源

研究細胞由北科生物細胞工程研究所提供。干細胞來自健康分娩孕婦的臍血和臍帶（產婦知情同意），均經過抗 HIV、梅毒抗體及肝炎標志物 5 項、Torch 5 項等檢測，經過分離、提取、培養、擴增，并傳至第 4～6 代。

1.3 方法

本研究采用非隨機、開放、對照、單中心 I 期臨床試驗設計，分為對照組（康復訓練治療）、臍血組（CBMNCs + 康復訓練治療）、混合組（CBMNCs 聯合 UCMSCs + 康復訓練治療）。其中臍血組：第 1 次治療采用 CBMNCs 靜脈途徑治療、后3 次采用 CBMNCs 腰椎穿刺蛛網膜下腔途徑治療；混合組：第 1 次采用 CBMNCs 靜脈途徑治療、第 2 次采用 CBMNCs 腰椎穿刺蛛網膜下腔途徑治療，后2 次均采用 UCMSCs 腰椎穿刺蛛網膜下腔途徑治療；三組患者均由濟南明天兒童康復中心專業康復師行感覺統合及行為康復訓練治療。干細胞治療共 4 次，每周 1 次，每次治療細胞數量為2×106/kg，共觀察 24周。試驗開始前獲山東省交通醫院倫理委員會審核批準，并根據國務院《醫療機構管理條例》的規定[3]獲得受試者監護人的知情同意。

1.4 評價指標

3組受試者行干細胞治療和康復訓練治療前和首次治療后2、4、8、16、24周分別進行 CARS、ABC 評估[4]。ABC 量表評估包括 58個小分項，分為易激惹、嗜睡、刻板行為、興奮性及不恰當語言 5個大分項，采用 0～3 分評分標準，分別代表不構成任何問題、只構成小問題、問題比較嚴重、問題非常嚴重。量表評估由山東省精神衛生中心作為第三方完成。

1.5 統計學分析

定量數據采用例數、均數、標準差描述，定性數據采用頻數、構成比或百分比描述。用 SPSS13.0統計軟件包進行統計分析，定量數據 3組間比較及治療前后比較分別采用多元方差分析以及重復測量方差分析，組間比較方差不齊時，采用Tambane’s T2 法分析，采用 Pearson 相關分析其ABC 與CARS 兩者相關性，以 P＜0.05 為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 ABC 各因子分析

由表1 可知，ABC 評分中嗜睡、刻板行為、興奮性及不恰當語言因子，24周時臍血組下降百分比分別為21.4%、42.0%、42.2%、62.5%。混合組下降百分比分別為48.4%、67.1%、60.7%、54.0%。對照組嗜睡、刻板行為及興奮因子下降百分比分別為12.9%、24.0%、16.4%，而不恰當語言因子，則由基線的（2.38±2.10）波動至（2.46±2.63），輕微上升 3.4%。

三組在24周隨訪點，ABC 嗜睡與刻板行為因子評分差異具有統計學意義（F=9.21，P＜0.05與F=3.93，P＜0.05），兩兩比較可知，混合組分別與臍血組、對照組比較，具有顯著性差異（P＜0.05）。干細胞治療組與對照組間 ABC 興奮及不恰當語言因子在基線時評分差異具有統計學意義（F=5.99，P＜0.05 與F=4.09，P＜0.05），對照組明顯低于干細胞治療組，但在24周隨訪點三組間差異不具有統計學意義（F=1.02，P ＞0.05 與F=0.098，P ＞0.05）。易激惹因子評分三組在不同隨訪時間點的比較中，差異均無統計學意義（P ＞0.05）。

隨訪時間點各組組內比較，臍血組刻板行為因子基線評分與4、8、16、24周時比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）；混合組嗜睡及刻板行為因子評分 24周時與基線的比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）；對照組嗜睡因子評分24周時與基線的比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 三組資料 ABC 評分分項比較分析結果Table1 ABC subscale score of 3 groups

表2 三組資料 ABC 評分比較分析結果Table2 ABC score of 3 groups

2.2 ABC 總分分析及與CARS 評分相關性

2.2.1 ABC 總分分析 由表 2 可知，臍血組、混合組與對照組ABC 評分在隨訪時間內均有一定程度的下降，24周時下降百分比分別為38.0%、59.9%、17.4%，不同隨訪時間點的三組比較，其中 24周時三組的ABC 評分差異具有統計學意義（F=3.73，P＜0.05），兩兩比較可知，混合組分別與臍血組、對照組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），提示在24周時混合組ABC 評分明顯低于臍血組與對照組。三組ABC 評分各隨訪時間點與基線比較：混合組與對照組24周時與基線的比較、臍血組8、16、24周時與基線比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.2.2 ABC 總評分與CARS 總評分相關性分析 由表 3 可知，ABC 總評分與CARS 總評分呈正相關，且隨訪視時間點的延長，相關系數 r 由基線時的0.61 逐漸增加至 6個月時的0.87（P＜0.001），提示 ABC 與CARS 評估結果比較在干細胞治療前后的各個時間點具有密切相關性，因此量表 ABC 具有較高的效度。

表3 ABC 總評分與CARS 總評分相關性分析Table3 Correlation of ABC score and CARS score

3 討論

兒童孤獨癥屬于自閉癥譜系障礙的一個亞類，其病因尚未明確，但在病理改變上與中樞神經系統的組織血流灌流不足、腦組織形態學的改變以及免疫異常等密切相關。既往研究結果顯示，中樞神經血流灌流不足及其導致的組織缺血缺氧的程度與孤獨癥癥狀的嚴重程度密切相關。血流灌注不足導致的腦組織缺氧，不僅造成神經元細胞的凋亡和壞死，還可導致異常腦組織代謝和神經遞質的蓄積[4]。此外，孤獨癥患兒體內常存在星形膠質細胞、T 細胞、B 細胞等多種免疫細胞功能異常[5]。

目前尚無針對血流灌注不足及免疫功能異常病理基礎的有效藥物治療，而生物治療，尤其是干細胞治療有望成為改善孤獨癥臨床癥狀的有效手段之一。CBMNCs 含有許多未成熟干細胞，如CD34+ 細胞，具有很強的增殖、自我更新能力及多向分化潛能：體外適當條件下培養誘導后可表達神經干細胞及血管內皮祖細胞標記物；植入發育中的大鼠腦內可分化成神經元或神經膠質細胞，且能夠分泌多種生長因子及神經營養因子；CBMNCs側腦室移植可改善遠期行為學，對缺氧缺血性腦損傷治療有效，對新生動物損傷的腦組織有神經保護作用。有臨床研究表明，CBMNCs能有效改善血管性癡呆患者認知功能和日常生活能力，延緩和阻止病情發展，有助于神經功能的恢復，提高患者的生活質量。CD34+ 細胞在終末期心肌缺血及外周動脈疾病中用于誘導血管生成的治療已取得一定成果[6-9]。UCMSCs 可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞和神經細胞等多種成體細胞。MSCs能夠持續分泌白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等免疫抑制因子，可產生前列腺素-2（prostaglandin E-2，PGE-2）、色氨酸分解代謝酶吲哚胺 2，3-雙氧化酶（tryptophan catabolizing enzyme indoleamine 2, 3-dioxygenase）和半乳凝集素-1（galectin-1）等多種免疫調節因子，并可以通過抑制樹突狀細胞的成熟與抗原提呈能力達到非特異性調節免疫應答的作用。另有調查發現，30%～75% 患兒存在神經系統發育不完善或發育異常，前額葉的不正常發育可能解釋孤獨癥的強迫性行為。MNCs 與UCMSCs 表達的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）、睫狀神經營養因子（giliary neurotrophic factor，GNTF）、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）等因子有利于促進神經元的再生；它們還可以向神經細胞方向分化，表達神經細胞的相關標記物，有望替代和修復受損組織，改善并提高神經系統功能[10-12]。

本研究應用 CBMNCs 以及CBMNCs 聯合UCMSCs結合康復訓練治療兒童孤獨癥，采用ABC 量表對治療效果進行評估，結果提示干細胞聯合康復訓練治療療效明顯優于單純康復訓練對照組，其中混合組治療效果最優，臍血組療效次之。對 ABC 評分各分項進行分析，除了易激惹分項在不同隨訪時間點的三組比較中無差異外，嗜睡、刻板行為因子評分，三組治療方式都有一定程度的改善，其中混合組的療效最好；對興奮因子及不恰當語言因子評分，干細胞治療組與對照組在基線時ABC 興奮評分存在很大差異，但隨著治療進展，最終 24周隨訪，三組興奮及不恰當語言因子評分到達同一個水平。對照組24周時，嗜睡因子改善明顯，而臍血組和混合組24周時，不僅嗜睡因子改善明顯，且刻板行為因子改善亦有統計學差異，說明干細胞治療在刻板行為因子改善方面明顯優于傳統康復訓練。分析干細胞治療發揮作用可能是由于改變了這些改善癥狀相應在神經系統定位部位（島葉、杏仁核、顳葉、前額葉、尾狀核和小腦等）的遞質分泌或者改善了病變部位的血液循環而促進了機體神經功能的恢復。

目前在我國多采用 CARS 及孤獨癥行為量表（autism behavior checklist）作為評價兒童孤獨癥病情的工具，但這些量表難以充分反映兒童孤獨癥臨床癥狀變化，尚缺乏高效、實用、適合普及的孤獨癥篩查量表。國內外多項研究證實，ABC 量表適于兒童孤獨癥的臨床量化評估[13-16]，國內學者馬俊紅等[17]最新研究發現，ABC 中文版具有較好評定者信度及重測信度，該量表各因子內部一致性信度相當好；ABC 中文版各因子與CARS、孤獨癥行為評定量表、Conner 父母評定量表及Achenbach兒童行為量表的相應因子間呈正相關（r 在0.27到 0.67 之間，均 P＜0.01）；并驗證性因素分析檢驗了結構的有效性。本項研究亦發現，ABC 與CARS的評估結果在干細胞治療前后的各個時間點均具有密切相關性，兩者相關系數由基線時的0.60逐漸升至 24周時的0.87（P＜0.001），在評價兒童孤獨癥療效時具有較高的效價。綜合以上研究可以得出結論：量表 ABC 具有較高的效度，可以作為診斷與評定兒童孤獨癥的有力工具之一。ABC與CARS 可以從不同的角度對孤獨癥的病情進行評估，我們認為與CARS 量表相比，ABC 量表各個分項更加具體，在臨床應用中具有更高的敏感性和可操作性，且操作簡便，具有更高的臨床應用推廣價值。

本研究結果提示，聯合應用 CBMNCs和UCMSCs結合康復訓練治療兒童孤獨癥的療效顯著高于傳統的康復訓練治療，且 ABC 量表對評估兒童孤獨癥具有較高的效度。鑒于納入本次研究的病例數相對較少，隨訪時間較短，對遠期療效未進行觀察評估，以及對干細胞發揮療效的確切機制尚未明確，該研究尚需開展隨機、雙盲、對照、多中心的臨床試驗進一步探討及深入。

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