HCV分子流行病學的研究進展

趙晶，孟令章，陶鈞，肖瑤，邢文革

分子流行病學是應用先進的技術檢測生物學標志的分布情況，結合流行病學現場研究方法，從分子或基因水平闡明疾病的病因及其相關的致病過程，并研究疾病的防治和促進健康的策略和措施的科學。自1989年美國學者 Choo等[1]應用分子克隆技術首先發現丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）以來，HCV的分子生物學、病毒分型、HCV感染的流行特征及與臨床關系等方面的研究都取得了很大進展。以 HCV的基因分型作為生物標志（biomarkers）進行的分子流行病學研究對 HCV 感染、傳播、診斷、治療及預防等方面均有重要意義。本文就 HCV的分型和分子流行病學國內外研究進展等方面進行綜述。

1 HCV 分型的研究進展

1.1 HCV的分型依據

HCV 具有顯著異源性和高度可變性。對已知全部基因組序列的HCV 株進行分析比較，其核苷酸和氨基酸序列存在較大差異，HCV 基因組各部位的變異程度不相一致，如5’-NCR 最保守，同源性在92%～100%，而 3’-NCR 區變異程度較高。在HCV的編碼基因中，C 區最保守，非結構（NS）區次之，囊膜蛋白 E2/NS1 編碼區可變性最高，稱為高可變區。

根據現有的HCV 分離株數據，HCV 基因多樣性主要表現在4個水平：①HCV 基因組的核苷酸序列變異 31%～33% 時，定為基因型；②基因組的核苷酸變異 20%～25%定為基因亞型；③HCV 基因組的核苷酸變異超過 10% 定為分離株；④感染者體內可同時存在不同的多種序列組成，但卻有很高同源性（同源性 ≥ 95%）的HCV 變異株群體稱為準種（quasispecies）[2]。

1.2 HCV 基因分型系統概況

目前至少有 4 種不同的HCV 基因型命名系統[3]，分別為Okomoto 系統、Cha 系統、Kanazawa 系統和Simmonds 系統。1993年Simmonds 依據不同病毒毒株編碼非結構蛋白 5（NS5）區域核苷酸序列的同源性，按照發現的先后將 HCV 分為1～6個型和11個主要的亞型，亞型以 a、b、c等表示[4]。該分型方法得到了大多數學者的認同。該分型法能與先前的各種分型命名法相對應，不僅協調了以前的分型命名方法，而且可以在多種分型系統中命名新的型和亞型。不同分型系統之間的對應關系見表1。

1.3 HCV 分型方法研究進展

目前 HCV 分型有多種方法，如：血清學分型法、核酸序列分析法、型特異性引物擴增分型、型特異探針雜交分型法和限制性長度多態性分析法（RFLP）等。

表1 HCV 基因型各種分型之間的對應關系

1.3.1 血清學分型 HCV 血清學分型技術是根據 HCV某些區域表達抗原具有與基因型對應的型別差異，合成特異性多肽作為包被抗原，對 HCV 血清抗體進行分型檢測。Murex HCV 血清分型試劑盒針對 HCV NS4 區的特異性抗體，對 HCV 進行血清學分型。Murex HCV 血清分型實驗雖不能區分亞型，但其分型結果對臨床治療具有一定指導作用[5]。

1.3.2 核酸序列分析法 隨著核酸測序技術的發展，直接測序分型成為目前具有推廣潛力的HCV 基因型檢測方法。該方法需要對 HCV RNA 進行巢式 PCR 擴增，它使用兩對引物，進行兩次 PCR 反應，能夠極大地增加 PCR 擴增反應的敏感性和特異性。套式 PCR 第二次反應的引物（內引物）位于第一次 PCR 擴增區域內。外引物進行第一次PCR 擴增后，將擴增產物轉移至第二次 PCR 反應管內，使用一對內引物進行第二次 PCR 擴增反應，最后用凝膠電泳鑒定擴增產物并測序。HCV的核酸序列分析法是 HCV分型中最經典、最可靠的分型方法，許多其他的分型方法都將序列分型作為參考標準。

1.3.3 型特異性引物擴增分型 根據不同 HCV 基因型在某一區段（主要是保守區）序列的差異，設計一系列型特異性引物。不同 HCV 基因型可擴增出長度大小不同的片段，并以此分型。這個方法是目前國內外學者較為廣泛應用的方法。他們分別根據各自地區需要區分的不同型別的HCV 基因序列設計了 5’NTR 區、C 區、NS5B 區的特異性引物，將該地區的基因型及亞型很好地分開。此方法由于不同學者采用的設計引物的基因型不同，設計引物的區域不同，想要進行 HCV 基因分型的型別不同，采用的引物和引物數目各不相同，因此不利于結果間的比較。

1.3.4 型特異探針雜交分型 通過生物素標記的引物擴增HCV 病毒基因組中 5’非翻譯區的保守序列，利用固定于膜上的型特異性探針與擴增產物進行雜交，通過互補結合后，可直接與鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶結合物結合，再通過底物作用而在相應的探針位置出現雜交信號，即可以此進行結果判斷[6]。該方法敏感性高、特異性強、雜交信號明顯、結果易判斷，且能區分多種基因型，是較為理想、方便、實用的分型方法。

應用此原理的目前較廣泛使用的是 LiPA HCV 基因分型 2.0 試劑盒。相比第一代產品，二代 LiPA HCV 增加了核心區序列，可準確地區分 1a和1b 型，并可避免東南亞地區和我國南部地區較常見的6c-6l 型被誤分為1 型，但仍約有 8%的2a 型易被誤判為1a 型，而這兩種型別的HCV 感染的治療和預后均存在較大差異。需要注意，LiPA要經過 PCR 擴增，對 HCV 混合感染進行分型時，不可避免會因不同型別 RNA 擴增效率不一造成的劣勢擴增毒株的漏檢。

1.3.5 限制性長度多態性分析法（restriction fragment length polymorphisms，RFLP） HCV 不同基因型某一區段個別堿基的變異可直接導致某些酶切位點的改變。RFLP 法一般選 5’NTR 區和NS5B 區作為RFLP 分型的靶基因。PCR 擴增靶基因得到的產物用不同的限制性內切酶進行酶切，不同型或亞型得到不同長度大小的片段，然后根據酶切后電泳所表現的片段大小及多態性進行基因分型。

2 HCV 分子流行病學研究進展

2.1 HCV 基因型的地區分布特征

目前已經發現了 HCV 有 6 種基因型和上百種基因亞型。研究表明，HCV 基因亞型的分布與地區有關。1a、1b、2a、2b和3a 呈世界性分布，造成絕大多數的HCV 感染[7]。圖 1 展示了 20 世紀部分國家和地區的HCV 流行的主要基因型或亞型[2]。圖中 1a亞型流行于北歐、美國；1b亞型廣泛分布于世界各個地區；2 型分布于地中海、東亞；3 型主要分布于歐洲；4 型分布于中東；5 型廣泛分布于南非；6 型主要分布于中國香港、越南、澳大利亞。

按照地理位置由西向東，對近年來 HCV 基因亞型的地區分布的研究進展總結如下：西方國家共同的基因型 1 型（1a、1b）和2 型（2a、2b、2c）在過去的50～70年廣泛分布于歐洲和北美洲，目前 1 型（1a、1b）仍為西歐和美國的主要亞型。地中海巴爾干半島 1b亞型最高，同中歐、西歐的臨界國情況相同，但是希臘除外（3a亞型最多）[8]。非洲的流行情況為：西非主要流行 2 型；中非（剛果共和國、加蓬共和國等）主要流行 1 型、4 型；北非（埃及）主要流行 4 型[9-12]。中東地區：阿拉伯國家主要流行 4 型，然而非阿拉伯國家主要流行 1a和1b 兩種亞型[13]。亞洲國家以 1b亞型為主，2a亞型次之。東南亞主要流行 3 型和6 型。需要特別說明的是：撒哈拉以南非洲和東南亞 HCV亞型多樣化，且出現較多的HCV亞型重組（原因可能為反復共用針具吸毒等）。由于基因亞型檢測方法的局限，通常檢測出的亞型為感染者體內的占優勢的亞型。因此，對于如撒哈拉以南非洲和東南亞 HCV亞型多樣化的地區，亞型檢測不能準確描述個體的感染狀況，而且在流行病學上的意義比較小。

圖1 20 世紀部分國家和地區的HCV 流行的主要基因型或亞型

圖2 HCV 數據庫收錄的中國 HCV 序列亞型構成比

對于中國 HCV 基因亞型的研究，以往諸多資料表明以1b和2a 兩種亞型為主。近年來研究顯示，在我國南方廣西、武漢、貴州等省市吸毒人群中，6a亞型為主要亞型。圖 2 展示了 HCV 數據庫截止到 2010年7 月收錄的中國 HCV 序列亞型的構成比[14]。根據數據庫的說明，此圖不能代表 HCV 各亞型在中國分布的真實構成比，但是在一定程度上可以反映出中國 HCV 基因型和亞型分布的概況。

2.2 HCV 基因型的時間分布特征

HCV 基因組突變率以（1.5～2.0）×10-3/（堿基×年）來算，HCV 基因型、亞型分別于500～2000年和100～300年前形成。根據各亞型進化的基因距離推論，1b亞型和2 型的進化時間較長，是古老的亞型，其他亞型進化時間較短。諸多研究結果顯示，隨著時間的推移，1b亞型和2 型有逐漸被其他亞型取代的趨勢，如：巴基斯坦的3a亞型在20 世紀 20年代出現，在50年代開始快速增長；在法國 1983年后才出現 3 型，現在已成為該國的流行亞型，最近該國又出現 4 型和1a亞型大幅度上升而 lb亞型和2 型下降的現象；塞爾維亞的研究中，小于40 歲的年齡組3 型所占比例顯著多于40 歲以上年齡組，且顯示隨時間推移 1b亞型所占比例降低；澳大利亞一篇研究匯總了 1996–1998年3年的亞型分布研究，可以看出1 型構成比例有降低的趨勢，4 型有升高的趨勢[15]。

近幾十年，相對新的感染途徑導致 HCV的快速傳播[16-17]，如 20 世紀 40年代的不潔采血、共用注射器吸毒、用未經消毒的針頭進行注射和接種疫苗。這可能是 HCV 基因亞型變化的內在根源，因為研究顯示感染途徑與亞型密切相關。在我國，有關 HCV 流行史的研究較少。隨著感染時間的推移，人口的流動，主要感染途徑的變化，HCV 基因亞型在我國的流行應該呈現出一定的變化趨勢。HCV 分子流行病學的研究能夠揭示 HCV 在我國流行的過程，從而對HCV的防控措施和疫苗的研究提供重要的依據。

2.3 HCV 基因型的人群分布特征

近年來對 HCV 傳播途徑的認識越來越清晰，大量的研究已證實，lb、2 型、5 型與輸血、血制品或醫院內傳播有關，3a、1a、4 型、6 型與靜脈吸毒（IDU）關系密切，而其他傳播途徑與HCV 基因型間無明顯相關性[18]。其他研究表明：西方國家傳播途徑主要有經血傳播、IDU、介入性治療及手術；比利時的一項研究報道了如醫療職業暴露、紋身、有創身體裝飾、母嬰等傳播途徑；Okamoto 報告日本血友病患者約 50% 為1a亞型感染，原因是輸入美國進口凝血因子 VIII；塞爾維亞的一項研究報道，腎透析病人和有很長 HCV 感染史的病人 HCV 不同基因型、亞型間的混合感染非常多[19]。

近年來諸多研究表明 IDU人群 HCV 感染率非常高，需要引起重視。Aceijas等[20]匯總了 1998–2005年的有關于IDU人群 HCV 感染的文獻，包括了 57個國家，152個地區。HCV 感染率分別為：東歐中亞 10%～96%；南亞東南亞 10%～100%；東亞和太平洋 34%～93%；北非中東5%～60%；拉美 2%～100%；北美 8%～90%；澳大利亞、新西蘭 25%～88%；西歐 2%～93%；只有哥倫比亞和黎巴嫩低于20%；中國、波蘭、波多黎各、俄羅斯、西班牙、瑞士、泰國、越南的IDU人群 HIV/HCV 共感染率為90%。另有對中國 1997 - 2006年間的105 篇關于IDU人群 HCV 患病率研究的分析結果顯示，中國 IDU人群的HCV 患病率為61.4%，感染最嚴重的省份和自治區為：湖北、云南、廣西壯族自治區、湖南和新疆維吾爾自治區[21]。以上數據充分說明了對 IDU人群進行 HCV 普查的必要性，特別是 HIV 陽性的IDU人群。

3 HCV 分子流行病研究對于臨床的意義

不同基因型對抗病毒治療的應答不同，采取的治療方案也不同，因此，基因型的測定有助于決定抗病毒療程和藥物劑量。根據臨床研究結果，在1 型患者中建議療程為1年，利巴韋林的用量要達到 1000～1200 mg/d，但是其持續病毒學應答（sustained virologic response，SVR）僅達到 40%～45%；而 2和3 型患者，療程半年，利巴韋林的用量只要800 mg/d 即可達到 70%～80%的SVR，延長療程或增加利巴韋林的用量都不能進一步提高持續病毒學應答率。根據不同的基因型調整療程和利巴韋林的用藥劑量，可以減少藥物的浪費，減輕藥物的不良反應，從而提高患者對治療的依從性。

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