慢性阻塞性肺疾病患者細胞凋亡和caspase-3的表達

梁憲梅,曾錦榮,夏春波

(1.廣西省桂林市第二人民醫院呼吸內科,廣西桂林,541001;2.桂林醫學院附屬醫院呼吸內科,廣西桂林,541001;3.桂林醫學院人體解剖學教研室,廣西 桂林,541004)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統常見疾病,具有較高的患病率和病死率,探討COPD的發病機制和新型治法是目前研究的熱點和難點[1]。COPD患者存在肺內細胞增殖和細胞死亡之間的平衡失調,細胞凋亡參與了COPD的發病過程[2]。半胱氨酸蛋白酶(caspase)在細胞凋亡中發揮重要作用,其中caspase-3的作用尤為突出。本研究通過檢測COPD患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞凋亡以及caspase-3水平,進一步闡明細胞凋亡以及caspase-3與COPD發生發展的關系,并為發病機制和治療方法的研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2005年2月～2009年7月本院就診的COPD患者43例,診斷符合慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007修訂版)[3],除外支氣管擴張、肺結核等疾患。選擇不吸煙COPD患者19例為不吸煙組,男11例,女8例,平均年齡63.8歲,平均病程5.4年;選擇吸煙COPD患者24例為吸煙組,男21例,女3例,平均年齡62.7歲,平均病程5.9年。另選健康志愿者15例為對照組,男9例,女6例,均無慢性支氣管炎、肺氣腫、COPD、哮喘等呼吸系統疾病史,無吸煙史,近1月內無呼吸道感染史,胸片及肺功能檢查均未見異常,所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

胎牛血清購自杭州四季青公司,細胞凋亡原位檢測試劑盒為德國Boehringer Mannheim公司產品。caspase-3 IgG購自Santa Cruz公司,工作濃度為1︰100。兔 SP檢測試劑盒(SP-9001)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9032)均購自北京中衫金橋生物技術有限公司,T riton X-100購自Generay公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 支氣管肺泡灌洗液收集、培養和細胞爬片:按文獻方法[4]進行,纖維支氣管鏡經鼻腔進入后予20 g/L利多卡因5 mL行常規局麻,快速注入37℃注射用生理鹽水50 mL×3次,并立即回抽液體至硅化的塑料容器內,回收的BALF放4℃保溫桶并立即送實驗室處理。用2層無菌紗布過濾BALF后,于低溫離心機離心10 min,將細胞成分用含胎牛血清的DMEM培養液(含青霉素1×105U/L、鏈霉素0.5×105U/L)培養,調整細胞濃度為5×109/L,將上述細胞懸液接種至預先放有蓋玻片的培養板中,置37℃、5%CO2的培養箱中貼壁2 h,吸出上清液,PBS輕輕漂洗,去掉未貼壁細胞,將細胞爬片取出,4%的多聚甲醛固定10 min,-20℃冰箱備用。

1.3.2 TUNEL法檢測細胞凋亡:細胞凋亡檢測采用T UNEL技術,嚴格按照說明書進行,以50 μ L標記液(不含末端轉換酶)代替 TUNEL反應混和液做陰性對照。細胞凋亡陽性判斷標準:細胞核內出現棕黑色或黑色顆粒為陽性細胞。計算方法:選擇5個以上具有代表性的高倍視野(×400),計數500個TUNEL染色陽性的細胞數即細胞凋亡數。凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.3.3 免疫細胞化學(SP)法檢測caspase-3表達:用3%H2O2 50 μ L處理10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性,PBS沖洗,加1%Triton X-100處理10 min,PBS沖洗,加入正常山羊血清工作液封閉20 min,傾去血清,滴加caspase-3一抗(1∶100)50 μ L,4 ℃過夜,PBS 沖洗 ,加入生物素標記二抗工作液50 μ L,37℃孵育40 min,PBS沖洗,加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液50 μ L,37℃孵育40 min,PBS沖洗,加新鮮配置的DAB工作液100 μ L顯色,以鏡下觀察為準,自來水沖洗 2 min終止反應,并復染、分色、返藍、脫水、透明、中性樹膠封片,鏡下觀察和照相。設0.01 MPBS代替一抗的陰性對照。結果評分:隨機取10個高倍鏡視野,每個視野計數100個細胞,以胞質出現棕黃色顆粒者為陽性細胞,以陽性細胞數低于細胞總數的5%為0分,5%～25%為1分,25%～50%為2分,50%～75%為3分,大于75%為4分。另一方面按陽性細胞中染色的強度積分,弱陽性為 1分,中等陽性為2分,強陽性為3分,將陽性細胞數積分與染色強度積分相加即為caspase-3表達水平。

2 結 果

2.1 COPD支氣管肺泡灌洗液病理學變化

細胞爬片經常規HE染色結果顯示,與對照組比較,吸煙組和不吸煙組均有較多的炎性細胞,其中以中性粒細胞、單核巨噬細胞和淋巴細胞多見。

2.2 COPD支氣管肺泡灌洗液細胞凋亡檢測

在光學顯微鏡下,可觀察到對照組、吸煙組和不吸煙組的凋亡細胞常單個散在分布,表現為核染色質致密濃縮,邊緣化,核膜裂解,染色質分割成塊狀等典型的凋亡形態。吸煙組和不吸煙組的凋亡指數分別為(31.22±8.45)、(29.30±7.11),與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.01)。吸煙組和不吸煙組BALF的細胞凋亡指數無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3 caspase-3在COPD支氣管肺泡灌洗液中的表達

免疫細胞化學結果顯示,caspase-3蛋白表達陽性染色主要位于細胞漿中,為粗細不一的棕黃色顆粒,吸煙組和不吸煙組的陽性細胞多呈彌漫性分布,正常對照組呈陰性或弱陽性表達。吸煙組和不吸煙組caspase-3表達積分分別為(5.74±1.83)、(5.39±1.26),與對照組比較,均有顯著性差異(P<0.01)。caspase-3蛋白在吸煙組和不吸煙組BALF中的表達積分無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 C OPD支氣管肺泡灌洗液細胞凋亡和caspase-3表達比較(±s)

表1 C OPD支氣管肺泡灌洗液細胞凋亡和caspase-3表達比較(±s)

與對照組比較,＊＊P<0.01。

組別 n 凋亡指數 caspase-3表達積分對照組 15 5.46±1.37 1.12±0.60不吸煙組 19 29.30±7.11＊＊ 5.39±1.26＊＊吸煙組 24 31.22±8.45＊＊ 5.74±1.83＊＊

3 討 論

COPD發病機制復雜,目前對其本質還未完全認識,可能與氧化應激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡、細胞因子、炎性介質等有關[5-6]。近年來,隨著對細胞凋亡通路基因調控研究的不斷深入,細胞凋亡與COPD發生發展關系的研究越來越受到人們的關注。有研究表明COPD患者存在著不同程度的肺實質細胞破壞、消失,炎細胞浸潤及氣道、血管結構重建[7],這表明COPD患者存在著肺內細胞增殖和細胞死亡的平衡失調。楊中飛等[8]研究結果顯示,COPD患者肺內肺泡上皮細胞和血管平滑肌細胞均存在不同程度的增殖、凋亡。肺泡上皮細胞凋亡、血管平滑肌增殖處于主導地位,其增殖凋亡的失衡可能在COPD發病進程中起一定作用。對支氣管肺泡灌洗液檢測結果顯示,COPD患者的凋亡指數明顯高于健康對照組(P<0.01),提示細胞凋亡可能是COPD發生發展的重要因素之一。另有報道,COPD患者肺內存在炎性細胞凋亡異常,肺泡巨噬細胞可應激性激活肺泡細胞產生炎癥導致炎性細胞浸潤,并最終導致肺氣腫的發展[9]。

凋亡或稱程序性細胞死亡(PCD)是由基因控制的細胞自主的有序細胞死亡,它的中心執行者是caspases家族,它的激活及調控在凋亡過程中發揮著極為重要的作用。caspase-3是參與細胞凋亡的caspase級聯反應的最終效應子,在蛋白酶級聯切割過程中處于核心位置。本研究結果顯示,COPD患者caspase-3表達積分均高于正常健康對照組(P<0.01),推測caspase-3在COPD患者支氣管肺泡灌洗液中發揮了重要作用,出現了細胞增殖和凋亡的失衡,最終導致COPD的發生發展。目前,COPD細胞凋亡機制尚未明確,可能與患者循環血中存在的凋亡調節因子異常有關,COPD線粒體發揮關鍵作用的是調節凋亡和釋放凋亡介質如細胞色素C等,細胞色素C從線粒體釋放出來,與凋亡蛋白酶激活因子-1和caspase-9結合,激活caspase-9,導致caspase-3的活化及隨后的細胞凋亡[10]。

長期吸煙是COPD的重要誘因,有報道顯示,吸煙與肺細胞氧化應激、細胞凋亡和基因表達密切相關[11]。Husari等[12]在探索COPD巨噬細胞凋亡的胞內機制時觀察到線粒體膜電位的破壞,細胞色素C的釋放,但并未發現caspase活化,即使采用數種caspase阻斷劑也不能抑制細胞凋亡,認為香煙誘導巨噬細胞凋亡的機制與caspase無關。另有報道,在人支氣管上皮細胞和孤立的線粒體,香煙煙霧提取物(CSE)接觸導致劑量依賴性抑制作用的同時,降低線粒體膜膜電位,增加線粒體氧耗,CSE可誘導caspase-3和caspase-7活動和誘導上皮細胞凋亡到壞死,誘導線粒體功能紊亂[13]。本組研究發現,吸煙組細胞凋亡指數和caspase-3表達積分與不吸煙組均無顯著性差異(P>0.05),可能與吸煙量、吸煙時間及COPD伴發疾病等有關,其機制有待進一步研究。

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