纈沙坦對尼古丁損傷血管內皮依賴性舒張功能的保護作用及機制

羅宏麗 張青碧 肖順林 王述蓉

吸煙被認為是心血管疾病發生發展的重要危險因素，而尼古丁是煙草中的主要毒性物質。因此，尋找有效的藥物來對抗尼古丁的血管損害作用非常必要。血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑（ARB）是有效的且耐受性良好的降壓藥，已被廣泛用于防治心血管疾病。筆者前期實驗研究表明ACEI能通過清除氧自由基改善尼古丁對血管內皮的損傷[1]。本研究擬探討ARB纈沙坦對尼古丁誘導的血管內皮功能損害的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物。普通級SD大鼠28只，雌雄不拘，體質量220~250 g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，動物合格證號：陜動證字08-004。（2）儀器。PowerLab數據記錄和分析系統，包括軟件Chart 5.0以及硬件8通道橋式放大器（ADInstruments Co，澳大利亞），FT03C?張力換能器（Grass In?strument Co.Quincy，Mass,美國）；Myograph?恒溫器官浴漕（DMT，丹麥）；YH·YX-11型浮標式氧氣吸入器，上海醫療器械廠；XTZ-E型連續變倍體視顯微鏡，上海光學儀器廠；DH2500型電熱恒溫培養箱等。（3）試藥。尼古丁、氯化乙酰膽堿（ACh）、L-Nω-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、吲哚美辛（Indo）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司；纈沙坦購自天大藥業有限公司；DMEM培養基為西安華美生物工程公司產品。除吲哚美辛先用DMSO初溶，其余均用Krebs液溶解，所有試劑使用前用Krebs液稀釋。

1.2 標本制作 SD大鼠斷頭處死，迅速取出腸系膜上動脈，浸入冷的Krebs液中，顯微鏡下剝除外膜脂肪及部分結締組織，剪成長約1 mm的血管環。Krebs液組成（mmol/L）：NaCl 119、NaHCO315、KCl 4.6、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.6。

1.3 實驗分組及血管培養 將制備好的血管環放入盛有2 mL DMEM培養基的培養皿中，每個培養皿中放3~4段，并將血管環分為以下7個組。（1）空白對照組（C組）：加入與實驗組等體積的0.9%氯化鈉注射液。（2）尼古丁組（N組）：加入0.1 mmol/L尼古丁。（3）纈沙坦低、中、高劑量組（V1、V2、V3組）：先分別加入0.1、1、10 μmol/L纈沙坦，再加入0.1 mmol/L尼古丁。（4）L-NAME組（L組）或吲哚美辛組（I組）：先分別加入L-NAME（100 μmol/L）或Indo（10 μmol/L），再加入尼古丁（0.1 mmol/L）和纈沙坦（10 μmol/L）。各組血管環加完藥物之后置37℃恒溫培養箱，充以95%O2和5%CO2混和氣體，培養24 h后取出。配好的DMEM培養基臨用前加入L-谷氨酸584 mg/L、青霉素105U/L、鏈霉素100 mg/L。

1.4 血管張力實驗 血 管環培養24 h后取出，檢測其張力。實驗前，動脈環靜息負荷2 mN，每20 min換液1次，穩定1.5 h。然后以K+-Krebs液（含K+60 mmol/L）檢驗動脈環收縮性，2次收縮幅度相差<10%者用于實驗。K+-Krebs液組成為（mmol/L）：NaCl 60、NaHCO315、KCl 63.5、MgCl21.2、NaH2PO41.2、CaCl21.5和葡萄糖5.5。先用1 μmol/L去甲腎上腺素(NE)預收縮，待張力上升并穩定后，加入累積濃度（10-9~10-6mol/L）的乙酰膽堿（ACh）舒張血管，檢測內皮功能。以NE誘發的最大穩定收縮幅度為100%，ACh誘發的舒張幅度與NE誘發的最大穩定收縮幅度之比為血管的舒張率。

1.5 統計學處理 運 用SPSS 13.0軟件包進行統計分析，計量數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

表1 各組血管舒張率的比較 （n=8，%±s）

表1 各組血管舒張率的比較 （n=8，%±s）

logC為ACh濃度取對數值；**P<0.01

C組N組V1組V2組V3組I組L組F P C∶N N∶V1 N∶V2 N∶V3 V3∶I V3∶L-9 8.25±4.66 1.45±3.15 1.08±0.72 1.84±0.21 4.25±0.57 2.04±0.13 2.12±0.13 10.952**<0.001 0.734 0.718 0.013 0.046 0.054-8.5 19.44±9.28 5.78±4.50 6.23±0.93 9.56±4.03 14.36±1.93 8.53±1.03 7.43±1.03 10.750**<0.001 0.837 0.085<0.001 0.009 0.002-8 36.14±8.35 14.08±8.51 15.67±2.59 23.76±1.59 29.12±2.38 22.97±1.59 18.97±2.04 20.542**<0.001 0.515<0.001<0.001 0.014<0.001-7.5 55.23±11.37 25.70±5.89 28.36±3.05 35.18±4.34 41.02±4.63 34.43±3.72 30.51±2.03 23.896**<0.001 0.359 0.002<0.001 0.026 0.001-7 73.63±10.68 36.09±7.15 40.23±3.21 49.31±5.42 56.37±6.06 50.87±3.97 40.93±3.07 33.993**<0.001 0.186<0.001<0.001 0.081<0.001-6.5 88.11±7.39 48.94±7.31 53.68±5.01 65.75±5.96 73.27±7.75 60.76±5.37 55.32±5.26 35.646**<0.001 0.144<0.001<0.001<0.001<0.001-6 95.62±3.72 58.71±8.56 62.43±6.83 74.81±6.20 85.61±5.04 73.45±6.43 66.75±5.38 35.658**<0.001 0.235<0.001<0.001<0.001<0.001組別logC

2 結果

血管環與尼古丁共同培養24 h后，對ACh產生的最大舒張率顯著低于空白對照組（P<0.01），而除V2組logC為-9、-8.5外，中、高劑量的纈沙坦（V2、V3組）能明顯降低尼古丁對血管環內皮依賴性舒張反應的抑制（P<0.05或P<0.01）。除L組logC為-9外，與V3組比較，I組和L組均能使纈沙坦的保護作用明顯降低，即ACh產生的最大舒張率顯著降低，差別均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

3 討論

內皮依賴性血管舒張反應降低是血管內皮功能不全的主要表現，也是動脈粥樣硬化早期的特征性改變，而且對動脈粥樣硬化的進展及并發癥（如血管痙攣、血栓形成）有重要影響。既往研究發現，ARB纈沙坦在平穩降壓的同時，能保護血管內皮細胞，改善血管內皮依賴性舒張功能[2]。乙酰膽堿誘導血管內皮釋放的內皮依賴性舒張因子主要有一氧化氮（NO）、前列環素（PGI2）和內皮依賴性超極化因子（EDHF）3種。NO和PGI2既是反映內皮細胞功能的重要指標，又是內皮細胞自我抗損傷的內源性保護因子，二者均具有消除氧自由基和抗氧化損傷的功能。

本研究顯示纈沙坦能明顯對抗尼古丁所誘導的血管內皮依賴性舒張功能的降低，且這一作用可被一氧化氮合酶抑制劑L-NAME和環氧酶抑制劑吲哚美辛所阻斷，提示纈沙坦的保護作用與其保護血管內皮釋放小分子活性物質NO和PGI2有關，初步說明NO/一氧化氮合酶（NOS）和環氧酶2條途徑均參與纈沙坦的血管內皮保護作用。有文獻報道，上述2條途徑分別由環磷酸鳥苷（cGMP）和環磷酸腺苷（cAMP）介導，同時又存在相互作用[3]。纈沙坦調節這2條信號通路的詳細機制尚待進一步研究。本實驗僅局限在NO和PGI2途徑，EDHF是否參與，或是否還有其他的機制，尚有待于進一步研究。本研究為動物離體實驗，今后將進一步前瞻性的開展長期吸煙者的臨床研究，使纈沙坦在預防、治療由吸煙引起的心血管疾病中發揮主要作用。

文獻報道，高血壓患者和健康志愿者分別單次予以纈沙坦160 mg、80 mg口服，服藥后24 h血藥濃度分別為457.8 μg/L、1 800 μg/L[4-5]。本實驗中所采用纈沙坦的濃度為0.1~10 μmol/L，其中高濃度10 μmol/L遠高于人體血藥濃度（1 μmol/L），但纈沙坦作用時間短，血管僅培養24 h，并且此濃度也與另外一些離體實驗采用的劑量相一致[6-7]，因此本研究中所采用的纈沙坦濃度還是比較合理的。

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