β-磷酸三鈣表面吸附P-15多肽對細胞相容性的影響*

趙 軍 沈文文 樊 洪

外傷、炎癥及腫瘤等常會造成口腔頜面部的骨質缺損，嚴重影響患者的生存質量，因此骨缺損修復的研究很有意義。β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）等人工合成的骨替代材料表面常常缺乏細胞與細胞之間、細胞與基質之間信息交流的機制而影響了細胞的黏附，并進一步影響細胞的增殖與分化。P-15多肽是Ⅰ型膠原中含有細胞結合位點的15個氨基酸序列的人工合成肽，參與成骨性細胞的黏附、增殖與分化等生物學行為。本研究旨在觀察β-TCP吸附P-15多肽后對細胞生長的影響，為進一步體內研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 β-TCP購自武漢華威生物材料工程有限公司，氣孔率為40%~70%，氣孔孔徑為10~1000μm，平均380μm，抗壓強度大于1.5×103kPa；P-15多肽凍干粉（GTPGPQGIAGQRGVV）由南京金思特科技有限公司合成，純度大于90%。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養液、胎牛血清（美國Gibco公司），Cell Counting Kit-8試劑盒（日本同仁化學研究所），堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程有限公司），BCATMpro?tein assay kit（Thermo Scientific），RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司），TJJ-1300超凈臺（北京半導體設備一廠），NAPCO細胞培養箱（美國Fisher公司），48孔培養板（Gibco），酶標儀（Thermo Labsysytems）。

1.3 方法

1.3.1 β-TCP/P-15復合材料的制備 將β-TCP修整成 5.0 mm×5.0mm×1.5mm大小，蒸餾水加壓反復沖洗，高壓蒸汽消毒備用。將P-15多肽溶解于PBS中，質量濃度為100 mg/L[1]，過濾除菌。然后將β-TCP放到P-15溶液中，輕微震蕩以確保P-15充分吸附到β-TCP中，室溫條件下放置24 h，再用PBS沖洗去除未吸附的P-15，干燥后室溫條件下儲存在防潮的容器中。

1.3.2 成肌細胞的培養與刺激誘導 復蘇由南開大學醫學院分子遺傳實驗室提供并凍存的鼠成肌細胞系C2C12，待細胞正常生長后向培養基中分別加入100 μg/L和200 μg/L的骨形成蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）刺激C2C12細胞向成骨細胞轉化。刺激液為含5%胎牛血清的DMEM培養液，培養4 d后測定堿性磷酸酶活性的變化。100 μg/L組、200 μg/L組及未刺激組的堿性磷酸酶活性分別為（1.98±0.07）U/g、（4.46±0.05）U/g及（0.53±0.02）U/g，后續實驗使用200 μg/L的BMP2刺激的C2C12細胞。

1.3.3 細胞與修復材料體外培養 將β-TCP/P-15（β-TCP/P-15組）與β-TCP（β-TCP組）分別浸泡在培養液中，24 h后取出，置于48孔板中，分別加入誘導培養的1.2×106/mL的C2C12細胞懸液10 μL，3~4 h后加培養液至500 μL，置于CO2孵育箱內、37℃及5%CO2的飽和濕度條件下培養6 d。

1.3.4 細胞增殖情況的測定 β-TCP/P-15組于培養后的2、4及6 d，吸棄剩余培養基后，于培養孔中重新加入180 μL新培養基和18 μL CCK-8試劑，于細胞培養箱中孵育1~4 h，每孔均取出110 μL培養基轉到96孔板中，用酶標儀選擇波長450 nm測定其光密度（OD）值，每個時間點測4孔，第1個時間點測定后下2個時間點重新選取含有材料的培養孔進行測定。同時以刺激誘導的細胞培養于β-TCP上生長作為對照組，在相同時間點上進行檢測。

1.3.5 蛋白質含量和堿性磷酸酶活性的檢測 β-TCP/P-15組分別于培養后的2、4、6 d各取8塊材料，分別用于蛋白質含量和堿性磷酸酶活性的檢測，每組每個時點4塊，消化收集細胞，PBS洗2遍,加入RIPA裂解液50 μL，冰上放置15 min，每5 min震蕩1次，12 000 r/min離心20 min，取上清液。（1）BCA法測定蛋白質含量：每個時點取4塊材料，按上述方法操作后，取上清液，測出各孔OD570的大小，根據標準曲線計算蛋白含量，同時以刺激誘導的細胞培養于β-TCP上生長作為對照組。（2）堿性磷酸酶活性的檢測：β-TCP/P-15組按上述操作，取上清液30 μL，加入標本測定管中，按堿性磷酸酶試劑盒說明進行檢測。堿性磷酸酶活性=（OD標本/OD標準）×酚的含量/蛋白質的含量。同時以刺激誘導的細胞培養于β-TCP上生長作為對照組，并比較2組中細胞在相同時間點的堿性磷酸酶活性的差異。

1.4 統計學分析 采 用SPSS 17.0軟件進行分析，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用2獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組材料對細胞增殖的影響 β-TCP組與β-TCP/P-15組的細胞增殖情況隨時間的延長而呈增加趨勢，β-TCP/P-15組較β-TCP組各相同時點細胞增殖明顯上升，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 CCK8法測定2組細胞增殖情況的比較（n=4，OD值±s）

表1 CCK8法測定2組細胞增殖情況的比較（n=4，OD值±s）

*P<0.05；表2、3同

組別β-TCP β-TCP/P-15 t 2 d 1.141 3±0.083 9 1.391 5±0.060 2 4.844*4 d 1.568 5±0.048 9 1.871 0±0.462 0 8.994*6 d 2.123 8±0.061 6 2.364 8±0.074 6 4.980*

2.2 2組細胞蛋白含量的比較 2組細胞與材料復合培養的細胞蛋白含量隨時間的延長而呈增加趨勢，β-TCP/P-15組較β-TCP組各相同時點蛋白含量明顯上升，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 BCA法測定2組細胞蛋白含量的比較（n=4，g/L±s）

表2 BCA法測定2組細胞蛋白含量的比較（n=4，g/L±s）

組別β-TCP β-TCP/P-15 t 2 d 0.620 0±0.042 4 0.820 0±0.077 5 4.529*4 d 1.000 0±0.021 2 1.360 0±0.033 7 15.123*6 d 1.480 0±0.108 0 1.847 5±0.094 3 5.126*

2.3 2組堿性磷酸酶活性的比較 在細胞與材料復合培養2 d時2組材料均未檢測出堿性磷酸酶的活性；培養4、6 d后β-TCP/P-15組較β-TCP組各相同時點堿性磷酸酶的活性明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

堿性磷酸酶是細胞向成骨細胞分化的標志之一，其活性水平代表了成骨細胞的分化程度，BMP2能夠誘導鼠成肌細胞系C2C12向成骨細胞方向轉化[2]。本研究結果顯示，刺激后C2C12堿性磷酸酶的活性明顯高于未刺激的C2C12堿性磷酸酶的活性，表明C2C12已向成骨細胞轉化。

Ⅰ型膠原可促進成骨細胞的黏附、增殖與分化，這些功能與其分子結構中含有特定的氨基酸序列有關。Bhatnagar等[3]檢測了Ⅰ型膠原的結構且在a1鏈中證實了有一段強力的細胞黏附性區域，此區域的序列為GTPGPQGIAGQRGVV（P-15）。然而在膠原分子的多鏈結構中，大部分結合位點未暴露而影響了細胞的黏附，采用克隆的方法將Ⅰ型膠原結合位點上這15個特殊氨基酸序列復制合成出來，得到的則是一種生物仿生材料[1]。P-15修飾材料后，可提高材料的生物活性，促進細胞的黏附與增殖，并且可促進細胞的分化能力。Emecen等[4]研究發現P-15與羥基磷灰石復合后能促進牙周膜纖維細胞的增殖及其細胞生長因子mRNA的表達。周炳榮等[5]合成了一種更短的多肽，含有6個氨基酸序列（P-6），其來源于P-15肽，并單獨用含有不同濃度P-6的培養液培養骨髓間質干細胞，結果表明P-6能促進細胞的增殖。Neiva等[6]在臨床試驗中也證實了P-15是一種很好的仿生材料。

β-TCP為人工骨材料，比羥基磷灰石具有更好的骨傳導性和生物降解性[7]，但其骨誘導能力較弱，形成的骨量很少[8]；并且材料表面親水性較差，對細胞的吸附力較弱，材料內部不能獲得足夠的細胞濃度，需要在其表面復合細胞膜受體所能識別的特異性蛋白質，以促進細胞與材料的結合。本研究將P-15復合到β-TCP表面，選用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況，相對于傳統的MTT法，其線性范圍更寬，靈敏度更高，且結果顯示P-15修飾后的材料在各個時間點均促進了細胞的增殖，表明β-TCP吸附P-15后，其表面性能得到改善，細胞易與材料結合，細胞復合后蛋白含量的測定結果與CCK8結果較一致，β-TCP經P-15修飾后細胞內的蛋白含量升高。另外，4、6 d時β-TCP/P-15組的堿性磷酸酶活性均高于β-TCP組，表明材料復合P-15后促進了細胞的分化，但在2個時點細胞堿性磷酸酶的活性均低于剛誘導完的C2C12的活性，考慮可能是誘導后的C2C12細胞還不穩定所致。

綜上，β-TCP吸附P-15后的生物相容性得到了一定的提高，但改變P-15的濃度對生物相容性是否有一定的影響尚有待于進一步的研究。

表3 2組細胞內堿性磷酸酶的活性 （n=4，U/g±s）

表3 2組細胞內堿性磷酸酶的活性 （n=4，U/g±s）

組別β-TCP β-TCP/P-15 t 4 d 1.12±0.05 1.36±0.02 7.466*6 d 1.58±0.03 2.32±0.05 27.969*

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