ABCA1基因啟動子區域VNTR-ZNF位點多態性及與血漿HDL水平的關系

高慎霞 毛用敏 陳 倩 趙莉莉 崔讓莊

血漿高密度脂蛋白（HDL）水平降低是冠心病（CHD）發生的獨立危險因素之一[1]。腺苷三磷酸（ATP）結合盒轉運體A1（ATP-binding cassette trans?porter A1，ABCA1）在啟動膽固醇逆轉運和HDL生成起始階段發揮著關鍵作用[2]。ABCA1基因序列中某些核苷酸變異可改變其活性并影響HDL水平[3]。ABCA1基因啟動子區域有多個轉錄因子的作用元件，其中-220 bp附近區域為ZNF202的結合位點，此處有一個同向重復序列可變數（variable number of tandem repeats，VNTR）多態位點，為ACCCC插入缺失變異（VNTR-ZNF）。本研究旨在對ABCA1基因啟動子區域VNTR-ZNF位點插入/缺失多態性進行觀察并探討其與血漿HDL水平的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機抽取天津市胸科醫院2007年9月—2009年4月住院的心肌梗死患者（按照WHO1979年診斷標準）166例（CHD組），其中男116例，女50例，平均年齡（56.2±9.7）歲，均有持續性胸骨后劇烈疼痛，血清心肌酶升高及心電圖ST-T變化。對照組99例，為同期本單位健康體檢者，其中男71例，女28例，平均年齡（51.9±7.4）歲。

1.2 方法 （ 1）基因組DNA制備采用Triton低滲緩沖液溶血法從白細胞中提取。（2）PCR擴增引物參照文獻設計[4]，上游引物：5′-CCC TAA GAC ACC TGC TGT ACCC-3；′下游引物：5′-CTG AGA ACC GGC TCT GTT GGT-3′。PCR（擴增體系反應體積為25 μL。各成分終濃度分別為：Tris-HCl 60 mmol/L，（NH4）2SO415 mmol/L，pH 9.5，MgCl22.5 mmol/L，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.2 mmol/L，引物各0.4 μmol/L，Taq酶 2 .5 U，模板DNA 0.5 μg。循環溫度：95℃5 min變性；95℃ 3 0 s、62℃ 3 0 s、72℃ 1 min，35個循環；最后72℃延伸7 min。（3）PCR擴增產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離基因型，用凝膠成像系統分析結果。（4）血脂測定：HDL及HDL亞組采用PEG20000進行沉淀去除低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL），酶法測定上清液中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.3 統計學方法 根據公式計算各等位基因頻率，Har?dy-Weinberg公式計算各基因型（p+q=1，2pq=雜合型基因頻率）的理論值（野生型：樣本總數×p2；雜合突變：樣本總數×2pq；純合突變：樣本總數×q2），χ2檢驗檢測Hardy-Weinberg平衡吻合度。全部數據采用SPSS 10.0軟件進行分析，計量資料數據用x ±s表示，對照組和CHD組基因型頻率及等位基因頻率的比較用χ2檢驗，不同基因型HDL水平比較用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因型檢測結果 PCR擴增出ABCA1基因啟動子區域含-220 bp處ACCCC插入和缺失的基因片段，經電泳分離，插入型顯示200 bp 1個條帶，缺失型顯示195 bp 1個條帶，雜合子顯示200 bp、195 bp 2個條帶，見圖1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡 本研究所選人群群體代表性好（均P>0.05），能反映天津地區人群的總體情況，見表1。

表12 組ABCA1基因VNTR-ZNF位點多態基因型實際值與理論值

2.3 被檢人群基因型和等位基因頻率的分布狀況 CHD組和對照組基因型頻率和等位基因頻率在2組間分布差異無統計學意義（P>0.05），見表2。被檢總人群等位基因頻率分別為插入型31.3%（166/530），缺失型68.7%（364/530）；基因型頻率分別為插入型6.4%（17/265），缺失型43.8%（116/265），插入/缺失型49.8%（132/265）。

表2 2組基因型頻率及等位基因頻率分布

2.4 血漿HDL-C在不同基因型中的水平 CHD組和對照組2組內各基因型間HDL及HDL亞組分水平差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

表3 2組不同基因型血漿HDL-C水平比較（mmol/L±s）

表3 2組不同基因型血漿HDL-C水平比較（mmol/L±s）

雜合子為插入/缺失型；均P>0.05

插入型雜合子缺失型F n 5 5 1 43 HDL 1.38±0.30 1.26±0.33 1.22±0.27 0.724 HDL2 0.51±0.17 0.49±0.22 0.49±0.19 0.038 HDL3 0.87±0.17 0.77±0.15 0.74±0.15 1.574 n 12 81 73 HDL 0.88±0.27 0.91±0.25 0.92±0.21 0.143 HDL2 0.36±0.16 0.35±0.16 0.35±0.12 0.013 HDL3 0.53±0.13 0.56±0.13 0.57±0.12 0.706對照組 CHD組基因型

3 討論

ABCA1是參與并啟動膽固醇逆向轉運的重要蛋白[5]。ABCA1位于細胞膜，有2組跨膜結構，其細胞外環結構與載脂蛋白（Apo）AⅠ相連。當細胞內膽固醇增多時，高爾基體將細胞內過剩的膽固醇轉到細胞膜，通過ABCA1的胞吐作用被轉運到HDL中的ApoAⅠ，HDL在接受膽固醇的同時從新生的盤狀轉變為成熟的球狀。ABCA1啟動膽固醇的外流對HDL的成熟和膽固醇的逆向轉運起到了重要的作用。

ABCA1基因位于9號染色體短臂，包含50個外顯子和49個內含子。其開放閱讀框架由6 783個核苷酸組成，編碼2 261個氨基酸。在ABCA1的基因序列中存在眾多的堿基變異，構成了不同的基因多態性。其中一些改變了氨基酸的組成，有些基因變異影響ABCA1的功能，使血漿中HDL水平升高或降低[6]。在ABCA1的啟動子區域也存在一些基因變異，可能會影響ABCA1的轉錄活性，使ABCA1的生成增加或減少，從而影響膽固醇的逆轉運和HDL的合成[7]。在ABCA1基因啟動子-220處存在1個ACCCC插入/缺失變異，這個區域恰是轉錄因子ZNF 202的結合位點，而ZNF 202對ABCA1的轉錄起下調作用[8]。關于ACCCC插入/缺失變異是否會影響ZNF 202與其結合從而影響血漿HDL水平，目前報道很少。本研究結果顯示ACCCC插入型等位基因頻率為31.3%；缺失型等位基因頻率為68.7%。由此產生的插入基因型頻率為6.4%；缺失基因型頻率為43.8%；插入/缺失基因型頻率為49.8%，天津地區人群這一位點基因型的分布與Probst等[4]報道的歐洲地區人群的基因型分布有明顯不同（插入型54.3%，缺失型4.4%，插入/缺失型41.3%），天津地區插入基因型頻率明顯低于歐洲地區，缺失基因型頻率明顯高于歐洲地區，提示這一位點基因變異可能與地區和種族有關。

本研究顯示HDL及其亞組分水平在不同基因型之間差異均無統計學意義。Probst等[4]報道高HDL（>1 000 mg/L）者中插入型占70.4%，高于低HDL（<500 mg/L）實驗者（54.4%），和中間HDL[（660±140）mg/L]實驗者（57.2%），但差異無統計學意義，此與本研究結果一致。電泳遷移率實驗（EMSA）顯示ACCCC缺失序列DNA片段與核蛋白提取物中的轉錄因子的結合能力強于插入序列，而ZNF 202可下調ABCA1的轉錄活性，故缺失基因型血漿HDL水平可能相對較低[4]。由于本研究檢測的樣本數較少，未發現基因型之間HDL水平的明顯差異，有待進一步研究。

[1]Abbott RD,Wilson PW,Kannel WB,et al.High density lipoprotein cholesterol,total cholesterol screening,and myocardial infarction:The Framingham Study[J].Arteriosclerosis,1988,8(3):207-211.

[2]Jonathan C,Cohen JC,Robert S,et al.Mulitiple rare alleles contrib?ute to low plasma levels of HDL cholesterol[J].Science,2004,305(6):869-872.

[3]Soro-Paavonen A,Naukkarinen J,Lee-Rueckert M,et al.Common ABCA1 variants,HDL levels,and cellular cholesterol efflux in sub?jects with familial low HDL[J].J Lipid Res,2007,48(6):1409-1416.

[4]Probst MC,Thumann H,Aslanidis C,et al.Screening for functional sequence variations and mutations in ABCA1[J].Atherosclerosis,2004,175(2):269-279.

[5]Field J,Watt K,Mathur SN.Origins of intestinalABCA1-mediated HDL-cholesterol[J].J Lipid Res,2008,49(12):2605-2619.

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[7]Kyriakou T,Hodgkinson C,Pontefract DE,et al.Genotypic Effect of the-565C>T polymorphism in the ABCA1 gene promoter on AB?CA1 expression and severity of atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(2):418-423.