生長激素受體外顯子3缺失多態性在矮小兒童與正常兒童中的分布比較

崔敬茹 鄭榮秀 劉戈力 楊箐巖 梁東春

隨著社會經濟的飛速發展，人們對身高的關注度越來越強，重組人生長激素（recombinant human growth hormone，rhGH）治療矮小癥也逐漸為人們所接受[1]。生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）是生長激素（growth hormone，GH）發揮作用的中介，GHR基因的多態性可能導致其在不同個體中的表達水平或功能上的差異。有研究表明外顯子3缺失的基因多態性可以導致GHR對GH反應性的不一致，從而導致不同個體對GH治療反應的不一致[2]，不同種族中GHR基因多態性分布不同[3]。本研究旨在了解矮小癥兒童和正常兒童GHR基因外顯子3缺失多態性的分布差異，為今后探討其是否與矮小癥的發病有關，并結合臨床指標建立可靠的GH治療預測模式奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 自 2009年9月—2010年6月于天津醫科大學總醫院小兒內分泌科就診的矮小癥患兒中選出滿足如下條件的143例作為試驗組：（1）身高處于同年齡、同性別正常健康兒童生長曲線第3個百分位數以下或低于2個標準差（SD），符合矮身材標準。（2）生長緩慢，生長速率<4 cm/年。（3）骨齡落后（2.5±0.4）歲。（4）頭顱磁共振結果顯示下丘腦-垂體區無異常。其中生長激素缺乏癥（growth hormone defi?ciency，GHD）58 例，小于胎齡兒（small for gestational age，SGA）40例，特發性矮小（idopathic short stature，ISS）45例，平均年齡（9.0±2.6）歲。收集同期在我院進行健康體檢的兒童，選取身高處于同年齡、同性別健康兒童生長曲線均值±1SD范圍的170例作為對照組，平均年齡（9.5±1.8）歲。每位自愿者取靜脈血3 mL，并簽訂知情同意書。乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 D NA提取采用天津潤泰科技發展有限公司生產的小量血液DNA提取試劑盒（產品代碼：GD2311-01）提取血液基因組DNA。紫外分光光度計，測定其光密度值。

1.2.2 目的基因擴增及PCR產物 GHR外顯子3缺失多態性的檢測參見文獻[4]中方法。PCR上游引物為G1：5′-TGT GCTGGTCTGTTGGTCTG-3′；下 游 2 條 引 物 分 別 為 G 2：5′-AGTCGTTCCTGGGACAGAGA-3；′ G 3 ： 5′-CCTGGATTAA CACTTTGCAGACTC-3′。PCR反應體系如下：10×PCR buffer 2.5 μL，Taq 聚合酶1 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1 μL，模板DNA 2 μL（含基因組DNA 50 ng），dNTP（10 mmol/L）2 μL，加三蒸水14.5 μL至總體積25 μL。經94℃預變性5 min，94℃變性30 s，65℃條件下退火30 s，72℃延伸90 s，循環35次，最后72℃延長7 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，紫外燈下判斷結果。3種基因型fl/fl（無外顯子3缺失的純合子），fl/d3（有一條染色體缺失外顯子3的雜合子）以及d3/d3（2條染色體都缺失外顯子3的純合子）的條帶。

1.3 統計學處理 根 據電泳結果條帶分布的不同計算各基因型頻數，通過公式（p+q=1，2 pq=雜合型基因頻率）計算各等位基因頻率。Hardy-Weinberg平衡公式計算各基因型的理論值（fl/fl：樣本總數×p2；fl/d3：樣本總數×2 pq；d3/d3：樣本總數×q2），χ2檢驗檢測Hardy-Weinberg平衡吻合度。采用SPSS 16.0統計軟件包進行數據分析，計數資料采用例（%）表示，2組GHR基因型頻率與等位基因頻率的分布差異、不同國家和地區間基因型頻率和等位基因頻率的分布差異及組間頻率差異分析采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR電泳結果 fl/fl為935 bp一條帶，fl/d3為935 bp和532 bp兩條帶，d3/d3為532 bp一條帶，見圖1。

2.2 Hardy-Weinberg平衡 結果顯示，本研究所選擇人群群體代表性較好，能夠反映出2組人群一般情況（P>0.05），見表1。

表1 2組GHR基因外顯子3缺失多態性基因型實際值與理論值

2.3 2組兒童GHR基因多態性分布情況 2組基因型及等位基因頻率分布差異均有統計學意義（均P<0.05），見表2。

表2 2組GHR基因外顯子3缺失多態性基因型分布

2.4 GHR基因型在不同國家和地區間的分布比較 將文獻[3，5-7]中報道的其他地區的GHR基因型與本研究中正常兒童和矮小兒童基因型的分布進行比較,本研究（天津）、邱旭升等（江蘇）和Audi等（西班牙）研究報道的fl/fl、fl/d3、d3/d3的頻數分布及fl和d3等位基因頻率差別均有統計學意義（P<0.01），見表3。本研究與Binder等（德國）和Audi等研究中的SGA患兒基因型分布差異無統計學意義（P>0.05），見表4。本研究與Jorge等（巴西）研究的GHD患兒基因型分布差異亦無統計學意義（P>0.05），見表5。

表3 不同地區正常人群GHR基因外顯子3缺失多態性基因型分布比較

表4 不同地區SGA的GHR基因外顯子3缺失多態性基因型分布比較 例（%）

表5 不同地區GHD的GHR基因外顯子3缺失多態性基因型分布比較 例（%）

3 討論

3.1 GHR基因及其基因的多態性 人GHR基因位于第5號染色體的短臂上，編碼一種含有620個氨基酸的單跨膜蛋白。該基因由10個外顯子組成，外顯子1是非編碼區，外顯子2編碼信號肽，外顯子3~7編碼細胞外結構域，外顯子8編碼跨膜結構域，外顯子9和10編碼細胞內結構域。GHR基因的外顯子3、6和10在人群中存在著多態性，并可能導致GHR在不同個體的表達水平或功能上的差異，進而影響GH生物學作用的發揮。發生在GHR外顯子6和10上的多態性為單核苷酸多態性，而編碼細胞外結構域外顯子3的多態性則是由外顯子3的保留（fl）或缺失（d3）構成的。

3.2 GHR外顯子3缺失多態性與rhGH治療矮小癥療效的相關性 近年來，rhGH已廣泛應用于兒科臨床，其治療矮小癥已取得了肯定的療效[7]，但接受治療的個體間卻存在著一定的療效差異。雖然許多因素可以影響rhGH治療效果，如開始治療時的年齡、身高、體質量、骨齡、GH激發試驗的峰值、rhGH的劑量、注射頻率、療程等，但所有這些因素只能部分解釋rhGH治療的個體差異，提示內在的遺傳因素可能存在一定作用。在可能影響rhGH治療反應性的基因中，GHR基因為重要的候選基因，其外顯子3缺失多態性與rhGH治療矮小癥療效相關性的研究越來越多。雖然Carrascosa等[8]研究顯示GHR外顯子3多態性與rhGH治療效果沒有相關性，但多數如Jorge等[5]、Binder等[6]和 Audi等[7]研究結果均顯示基因型為fl/d3和d3/d3的矮小癥患者rhGH的治療效果明顯優于基因型fl/fl的患者。此外，一項來自包括法國、新西蘭、英國和德國的240例SGA患兒的大規?？鐕芯勘砻鱃HR外顯子3多態性與患兒對rh?GH治療的反應有關[9]。由此推測GHR外顯子3缺失的患者可能對外源性GH治療更敏感。邱旭升等[3]及Audi等[7]報道的正常人群中d3等位基因頻率分別為0.138、0.441，而國內目前尚鮮見GHR基因外顯子3缺失多態性在矮小癥兒童和正常兒童的分布情況的報道。

3.3 不同人群GHR外顯子3缺失多態性的基因型和等位基因頻率分布 本研究顯示試驗組GHR 3種基因型fl/fl、fl/d3、d3/d3的分布頻數分別為71、58、14例，對照組分別為110、49、11例，前者基因型為fl/d3和d3/d3的比例明顯高于后者，且d3等位基因頻率亦高于后者，而本研究與Binder、Audi、Jorge等分別研究的德國人、西班牙人、巴西人中SGA和GHD患兒GHR基因型的分布差異均無統計學意義，推測GHR外顯子3的缺失可能與矮小癥的發病有一定關系。此外，本研究（天津）與邱旭升等（江蘇）和Audi等（西班牙）研究的正常人群中GHR基因外顯子3缺失多態性分布也不相同，這可以在一定程度上解釋不同地區和種族的人身高、體質量、骨骼發育等人體測量學的差異和不同種族間生長激素治療矮小癥患者療效的不同。

綜上所述，本研究得到了GHR基因外顯子3缺失多態性在矮小癥兒童和正常兒童中的分布情況，為進一步了解GH藥物遺傳學及矮小癥的發病機制以及將來根據基因型進行rhGH治療個體化，改善rhGH治療效果提供了依據。

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