CHE生物飼料發(fā)酵過(guò)程中活性酵母變化規(guī)律的研究

黃 亮 童應(yīng)凱 任 健 陳仁紹

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，抗生素等藥品的大量使用，飼料安全、食品安全問(wèn)題已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)者和消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。發(fā)酵飼料能有效地抑制消化道中大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及一些致病性細(xì)菌與病原體的繁殖與生長(zhǎng)，對(duì)豬疾病的防御有一定的功效，提高生豬產(chǎn)品的食品安全性[2]等。因此，世界各國(guó)近年來(lái)對(duì)豬發(fā)酵飼料特別重視，發(fā)酵飼料在我國(guó)也得到了較好的發(fā)展[1]。

CHE飼料的固態(tài)發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)微生態(tài)發(fā)酵的過(guò)程，固態(tài)發(fā)酵中多個(gè)菌種之間可互相補(bǔ)償其缺陷，進(jìn)行協(xié)同互生發(fā)酵[3]。目前用于固體發(fā)酵飼料的微生物，常見(jiàn)的有酵母菌、霉菌、芽孢桿菌和乳酸菌等。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)CHE生物飼料發(fā)酵過(guò)程中，測(cè)得的酵母活菌數(shù)和還原糖及粗蛋白的含量變化曲線可以更直觀地把握菌種的生長(zhǎng)與分解基質(zhì)情況，結(jié)合各類菌在發(fā)酵過(guò)程中的作用，可以人為地提高特定階段有利微生物數(shù)量，使基質(zhì)的發(fā)酵向最有利的方向進(jìn)行，最終為獲得優(yōu)質(zhì)高效的微生態(tài)生物飼料——CHE打下扎實(shí)的基礎(chǔ)，為我國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，生產(chǎn)無(wú)公害綠色肉、禽、蛋、奶打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

天津市祥華生物飼料有限公司CHE飼料樣品（每6 h取1次）。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%、瓊脂2%、pH值6.0。

察氏培養(yǎng)基：NaNO30.3%、KCl 0.05%、K2HPO40.1%、FeSO40.001%、MgSO4·7H2O 0.05%、瓊脂 2%，pH值6.7。

1.2 方法

1.2.1 活菌數(shù)測(cè)定

選用對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行微生物培養(yǎng)，具體方法參照杜連祥等[4]微生物試驗(yàn)技術(shù)試驗(yàn)，使用涂布平板法進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

圖1 菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序

1.2.2 還原糖含量的測(cè)定

使用3,5－二硝基水楊酸比色法對(duì)樣品中的還原糖含量進(jìn)行測(cè)定[9]。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的A540值對(duì)應(yīng)的還原糖c（mg/ml），然后按下式計(jì)算樣品中還原糖的含量。

還原糖含量(%)=c×樣品稀釋總體積（ml）×10－3/樣品質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原糖含量的測(cè)定結(jié)果及分析

2.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)

圖2 葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 發(fā)酵中還原糖含量的變化(見(jiàn)表1)

從表1可以看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵溫度在不斷地升高，中間出現(xiàn)微小的波動(dòng)，可能的原因是翻堆使料溫降低。第一次翻堆：從起始溫度16～48℃，經(jīng)歷了66 h后，進(jìn)行了第一次翻堆，翻堆后，發(fā)酵溫度經(jīng)歷短暫的平穩(wěn)期后，繼續(xù)升高；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，經(jīng)歷84 h后，發(fā)酵溫度升至55℃，進(jìn)行第二次翻堆，距離第一次翻堆24 h。6 h后，溫度降至50℃，這可能是因?yàn)檫M(jìn)行了第二次翻堆。之后，發(fā)酵溫度繼續(xù)升高；經(jīng)歷108 h后，發(fā)酵溫度升至58℃，進(jìn)行第三次翻堆，距離第二次翻堆24 h。6 h后，溫度降至55℃之后，料溫再次升高；120 h后，發(fā)酵溫度再次升至58℃，進(jìn)行第四次翻堆，距離第三次翻堆12 h。之后，料溫呈下降的趨勢(shì)，直至50℃，發(fā)酵結(jié)束，采用低溫烘干箱烘干。CHE飼料固態(tài)發(fā)酵中，在微生物作用下，能使原料從起始的16℃升至58℃高溫。

表1 CHE飼料發(fā)酵溫度及還原糖含量的監(jiān)測(cè)

CHE飼料發(fā)酵中還原糖含量在3.21%～4.88%上下波動(dòng)，可能是因?yàn)樵谖⑸锛捌洚a(chǎn)生的各類活性水解酶的作用下，促使高分子化合物淀粉、纖維素等分解為單糖，同時(shí)微生物的生長(zhǎng)也需要消耗部分所產(chǎn)生的還原糖，所以呈現(xiàn)出此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)，但其能在保證大量的活性益生菌的生長(zhǎng)時(shí)，保持3.21%的還原糖含量。

當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到78 h后，CHE飼料中還原糖的含量呈下降的趨勢(shì)，并最終穩(wěn)定在3.32%。這基本保證了發(fā)酵結(jié)束后CHE飼料成品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)（速效能源）及活性益生菌生長(zhǎng)所需的碳源。

將CHE－飼料發(fā)酵過(guò)程中溫度的變化與還原糖的含量變化曲線(取 1、4、8、12、16 和 23 號(hào)樣品)進(jìn)行比較分析，見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，在發(fā)酵前中期（0～114 h）還原糖含量的變化與發(fā)酵溫度無(wú)明顯相關(guān)，但在114 h，發(fā)酵溫度達(dá)到52℃后，還原糖呈下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦邷赜绊懥怂饷傅幕钚曰蚪湍妇纳L(zhǎng)。

圖3 發(fā)酵溫度與還原糖含量變化曲線比較

2.2 發(fā)酵過(guò)程中活性菌的生長(zhǎng)情況

使用涂布平板法，分別對(duì)樣品 1、4、8、12、16、20和23號(hào)等7個(gè)樣品進(jìn)行了活菌數(shù)測(cè)定，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間為2～4 d，測(cè)定結(jié)果以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，酵母菌活菌落數(shù)為縱坐標(biāo)，并將縱坐標(biāo)的刻度設(shè)為對(duì)數(shù)刻度后，見(jiàn)圖4。

圖4 酵母活菌數(shù)與發(fā)酵溫度變化曲線分析

從圖4可以看出，16～28℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母菌的數(shù)量隨著溫度和時(shí)間同步增加，處于菌量積累期；當(dāng)發(fā)酵溫度高于28℃后，直至50℃，酵母菌的生長(zhǎng)處于下滑期，這可能是因?yàn)椴荒透邷氐慕湍妇N類慢慢被淘汰；之后，從50～55℃時(shí)，酵母菌群得到快速生長(zhǎng)，可能的原因是經(jīng)高溫淘汰，剩余的耐高溫的優(yōu)勢(shì)酵母菌群得到繁殖和生長(zhǎng)，在55℃達(dá)到最大生長(zhǎng)值。隨后，發(fā)酵溫度降至50℃，離開(kāi)了耐高溫的優(yōu)勢(shì)酵母菌群的最適生長(zhǎng)溫度，生長(zhǎng)受抑制，生長(zhǎng)曲線呈下降趨勢(shì)，但降幅不大，因?yàn)橐呀?jīng)積累了相當(dāng)多數(shù)量的菌群。

在菌落計(jì)數(shù)過(guò)程中，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)不同階段的樣品在YEPD平板上，均長(zhǎng)有常見(jiàn)的釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母等。

3 討論

CHE生物飼料是祥華公司與天津農(nóng)學(xué)院經(jīng)過(guò)幾年的合作，于2005年成功研發(fā)的。CHE生物飼料是以富含酵母菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌等有益微生物的益生素為主要原料，添加低聚糖、消化酶、豆粕、玉米蛋白粉、鈣、磷等有益活性物，經(jīng)微生態(tài)發(fā)酵和低溫干燥新工藝，在大量有益微生物作用下，生產(chǎn)出來(lái)的集植物蛋白、菌體蛋白與復(fù)合酶于一體的生物飼料。

CHE飼料中積累了大量的酵母菌，能為牲畜提供優(yōu)質(zhì)的菌體蛋白、維生素、營(yíng)養(yǎng)素、風(fēng)味物質(zhì)、芳香類化合物和代謝化合物等，活性酵母能產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞分裂的生物活性物質(zhì)有強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)和抗病促長(zhǎng)的效果[1－2]。

4 結(jié)論

①CHE飼料發(fā)酵過(guò)程中溫度會(huì)隨著時(shí)間的增加而升高，最高可達(dá)58℃；經(jīng)過(guò)4次翻堆后，可以使發(fā)酵的溫度控制在58℃以下，并使發(fā)酵結(jié)束后的料溫控制在50℃左右。

②CHE飼料發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌得到了快速的繁殖，在發(fā)酵的后期，維持50～55℃的溫度，有利于酵母菌的積累。可通過(guò)增加發(fā)酵后期（50～55℃）的翻堆的次數(shù)，使發(fā)酵溫度控制在50～55℃。一方面，能促進(jìn)酵母菌活菌數(shù)量的快速積累；另一方面，能保證在發(fā)酵后期還原糖含量的穩(wěn)定，滿足微生物的生長(zhǎng)，及CHE飼料成品中還原糖的含量。

③在采集的CHE飼料樣品中，未見(jiàn)霉菌生長(zhǎng)（結(jié)果未列出）。但CHE飼料發(fā)酵過(guò)程中還原糖的含量基本維持在3.21%以上，最大值高達(dá)4.88%，考慮到霉菌產(chǎn)生的活性酶能水解CHE飼料發(fā)酵基質(zhì)中淀粉、纖維素等高分子化合物，后期優(yōu)化可在發(fā)酵環(huán)節(jié)中增加霉菌的添加量，以進(jìn)一步提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

[1]鄒志恒,宋瓊莉,韋啟鵝,等.發(fā)酵飼料在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用與研究進(jìn)展[J].中國(guó)動(dòng)物保健,2009(3):66－68.

[2]陸文清,胡起源.微生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)與應(yīng)用[J].飼料與畜牧，2008,7:5－9.

[3]張長(zhǎng)霞.混菌固態(tài)發(fā)酵蘋(píng)果渣生產(chǎn)蛋白飼料的研究[D].天津科技大學(xué),2004.

[4]杜連祥，路福平.微生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2008.

[5]張常書(shū).生態(tài)型低成本高效益養(yǎng)殖技術(shù)[J].湖南飼料,2000(1):15－18,29－30.

[6]陳敏.發(fā)酵稻草主產(chǎn)飼料蛋白優(yōu)良菌種的篩選[J].飼料研究，1999(9):32－34.