高效液相色譜法測定飼料添加劑中鹽酸林可霉素的含量

程建國 宋艷紅 王仲琴 徐 景 趙晶晶

鹽酸林可霉素又稱鹽酸潔霉素，主要用于治療革蘭氏陽性菌和支原體感染。對葡萄球菌、溶血性鏈球菌作用較強，對厭氧菌如破傷風梭菌、產氣莢膜芽孢桿菌有抑制作用，對豬痢疾密螺旋體和弓形蟲也有一定作用。用作飼料添加劑時，可促進肉雞和育肥豬的生長，提高飼料利用率。因此，鹽酸林可霉素常被加在育肥豬和肉雞飼料添加劑中，為了更好地控制飼料添加劑的質量，我們對高效液相色譜法測定飼料中鹽酸林可霉素含量的方法進行了研究。

1 儀器與試藥

WATERS2695高效液相色譜儀（包括四元泵，DAD 檢測器，柱溫箱，10 μl自動進樣器）；KQ－100超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司生產）；Thermo sorvall型離心機；Sartorius BP210S型電子天平。

鹽酸林可霉素對照品 (中國獸醫藥品監察所生產，批號：K0101003，含量 84.9%)，甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。供試品為育肥豬飼料添加劑，添加量為5%。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸林可霉素對照品0.05892 g(含鹽酸林可霉素0.05002 g)，置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml中含0.5002 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取供試品5.0 g 7份，分別置25 ml離心管中，精密稱取對照品，①0.26 mg、②2.61 mg、③4.72 mg、④6.25 mg、⑤7.76 mg、⑥8.69 mg、⑦0 mg 分別添加入①～⑦號供試品中，編號一一對應，其中⑦號供試品作為空白樣品，取上述供試品，分別精密加入甲醇15 ml，使供試品濕潤，輕輕搖勻，超聲20 min，5000轉離心5 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾后，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

Inertsil ODS－3 色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相[1]：0.05 mol/l硼砂溶液： 甲醇（55： 45）；流速：1.0 ml/min；檢測波長[2]：214 nm；柱溫：25 ℃；進樣量10 μl，出峰時間快，峰形比較好，按上述條件檢測對照品溶液結果如圖1，空白樣品結果如圖2，供試品溶液結果如圖3。

圖1 對照品結果

圖2 空白樣品結果

圖3 供試品結果

2.3.1 色譜柱的理論塔板數

在2.3的條件下，注入對照品溶液，鹽酸林可霉素保留時間為9.2min，林可霉素B峰保留時間為4.7min，鹽酸林可霉素峰半峰高寬（Wh/2）為0.42 min，計算色譜柱的理論板數為2658。鹽酸林可霉素和林可霉素B，兩峰之間的分離度為5。

2.3.2 拖尾因子

將2.1項配制的對照品溶液按2.3條件測得林可霉素峰W0.05h為1.08 min，峰極大至峰前沿的距離d1為0.53 min，拖尾因子T為1.02，同樣測得林可霉素B峰 W0.05h為 0.52 min，d1為 0.25 min，T 為 1.04，二者拖尾因子均在0.95～1.05。

2.4 線性關系考察

將對照品添加制成的①～⑥號溶液，按2.2色譜條件測定，結果見表1。以峰面積積分值為縱坐標，對照品質量為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=1×106x+2030.6，R2=0.9987，表明林可霉素在 14.7～492 μg/ml范圍內呈線性關系。

表1 線性范圍考察結果

2.5 靈敏度

用2.2項配制的供試品溶液，按信噪比為3時測得鹽酸林可霉素的檢測限為0.15 μg，當信噪比為10時測得鹽酸林可霉素的定量限為0.49 μg。

2.6 精密度

取2.2供試品④號（0.354 mg/ml）溶液，連續進樣5次，峰面積結果分別為 492017、493356、492786、492394、494011，平均 680980,RSD=0.16%（n=5）。

2.7 穩定性試驗

取2.1對照品溶液(0.5002 mg/ml)和2.2供試品④號溶液（0.354 mg/ml）按2.3條件進樣檢測，每隔一定時間進樣一次，結果見表2。表明在5 h內，對照品和供試品溶液穩定性良好。

表2 穩定性試驗結果

2.8 回收率試驗

采用加樣回收法，鹽酸林可霉素在育肥豬飼料中的添加量為每千克飼料添加40～70 mg，試驗所用供試品為5%添加的育肥豬飼料添加劑，這樣鹽酸林可霉素在添加劑中的含量為0.8～1.4 mg/g，試驗中選取了0.8、1.1、1.4 mg/g三個添加濃度來測定回收率，每個濃度添加3份，結果見表3。

3 討論

表3 回收率試驗

對供試品的超聲提取時間進行了考察，分別設定10、15、20、25、30 min，從檢測結果來看，提取 20 min，檢測結果穩定，回收率均在97%～100%，因此定為20 min。

4 結論

本研究所采用的檢測方法，靈敏、可靠、檢測結果穩定，可用于飼料添加劑中鹽酸林可霉素含量的檢測。

[1]陳明,耿志明,王冉,等.高效液相色譜法測定飼料中林可霉素的含量[J].江蘇農業學報,2008,24(1):99-100.

[2]中華人民共和國農業部《中國獸藥典》2005版第一冊.