乳酸菌固態混合發酵研究

方芳 張恒 賈建波 趙玉萍 張海寧 呂華清

生物飼料，即微生物飼料，是在微生態理論指導下采用已知有益的微生物與飼料混合，經發酵、干燥等特殊工藝制成的含活性益生菌的安全、無污染、無殘留的優質飼料，與發酵前相比，營養價值提高了，抗營養因子減少了，對動物有一定的促生長作用，可以用來喂豬、魚、鴨等[1-3]。保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌由于具有調節腸道、促進消化等功能,被眾多學者認為是生產益生菌劑的理想菌種。目前對于這三種乳酸菌分別進行固態發酵的研究已有一些報道[4-5]，但對此進行混菌固態發酵的研究還不多見[6]。因此本實驗選用玉米粉、麥麩、豆粕這些市場上易購的廉價飼料原料作為固態基質，對這三種乳酸菌進行固態混合發酵，優化固態發酵條件，測定發酵產物的粗蛋白質、粗脂肪和氨基酸態氮含量，為開發一種新型生物飼料打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

保加利亞乳桿菌 (Lactobacillus Bulgaria,以下簡稱 LB)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus,以下簡稱LA)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermopiles,以下簡稱ST)由淮陰工學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器設備

恒溫培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、消化爐、定氮儀、分光光度計、索氏提取器等。

1.3 培養基

LB、LA和ST的活化用MRS液體培養基。

固態發酵培養基：①玉米粉：豆粕：麥麩=2：1：1；②玉米粉：豆粕：麥麩=1：2：1；③玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：2；④玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1；均添加 5%的葡萄糖、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.15 g。

LB、LA和ST的活菌數測定采用BBL培養基，參照辛若竹等[7]的測定方法。

1.4 固態發酵培養條件的優化

先對固態基質4種不同配比、接種量（6%、8%、10%、12%）、培養基初始含水量（60%、70%、80%、90%）、培養基初始 pH 值（5.0、5.7、6.3、7.0）和發酵溫度（35、37、40、42℃）分別進行單因素試驗，再對后4個因素進行L9(34)正交試驗（因素水平見表1），以LB、LA和ST三種菌活菌數的平均值為指標確定固態發酵條件的最佳組合[8-11]。

表1 正交試驗因素水平

1.5 發酵產物常規營養成分測定[12-14]

粗蛋白含量的測定：采用凱氏定氮法；氨基酸態氮含量的測定：采用甲醛法；粗脂肪含量測定：采用索氏提取法。

2 結果與分析

2.1 固態基質不同配比對混合菌種發酵影響

在每個三角瓶固態基質總質量為40 g，培養基初始含水量為70%、pH值為5.7、接種量為8%、LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發酵溫度為37℃、靜置培養4 d的條件下，比較研究了固態基質4種不同配比對乳酸菌固態混合發酵的影響。由圖1可以看出，LB、LA和ST的最適固態基質配比分別為④、③、④。從綜合評分來看，三種菌混合固態發酵的最適固態基質配比為④，其次為②、③、①。因此，當玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1時，營養配比最適于三種菌的共同生長。

圖1 固態基質不同配比對乳酸菌固態混合發酵的影響

2.2 接種量的選擇

圖2 接種量對乳酸菌固態混合發酵的影響

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養基初始含水量為70%、pH值為5.7，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發酵溫度為37℃、靜置培養4 d的條件下，比較研究了不同的接種量對乳酸菌固態混合發酵的影響。由圖2可以看出,在接種量為6%時三種菌生長都很少,隨著接種量的增加,三種菌基本都呈先增加后減少的趨勢,且在接種量為10%時綜合評分達到最大值。因此,選擇10%為此固態發酵的最佳接種量。由此可見，在一定的接種量范圍內,增大接種量可使菌體數快速增長,增加發酵中的活菌數,縮短發酵周期；但如果接種量太大,培養基中營養物質不能滿足菌體生長需要,進而會限制菌體的生長，使發酵后的活菌數減少[8]。

2.3 培養基初始含水量的選擇

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養基初始pH值為5.7、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發酵溫度為37℃、靜置培養4 d條件下，比較研究了培養基不同的初始含水量對乳酸菌固態混合發酵的影響。由圖3可以看出,隨著培養基初始含水量的增大,發酵后的三種菌數都呈先增加后減少的趨勢,且都在含水量為80%時達到最大值。這是因為如果固態發酵培養基初始含水量過高,會使培養基黏度增大,導致培養基通透性降低,使菌體生長緩慢;而含水量過低,則水分供應不足,也會限制菌體的生長繁殖,進而影響發酵效果。因此,選擇80%的含水量作為三菌混合固態發酵培養基最佳的初始含水量[8]。

圖3 培養基初始含水量對乳酸菌固態混合發酵的影響

2.4 培養基初始pH值的選擇

圖4 培養基初始pH值對乳酸菌固態混合發酵的影響

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養基初始含水量為80%、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發酵溫度為37℃、靜置培養4 d條件下，比較研究了培養基不同的初始pH值對乳酸菌固態混合發酵的影響。不同微生物生長所需的適宜pH值不同，LB生長適宜pH值為5.8～6.2[10]，LA生長適宜pH值為 5.5～6.2[8－9]，ST 生長適宜 pH 值為 6.5～7.0[11]。由圖 4可以看出,LB和LA在pH值為5.7時分別達到最大值 3.2×109CFU/g和 4.9×109CFU/g，而 ST 則在 pH 值為6.3時達到最大值4.6×109CFU/g。通過綜合評分，選擇pH值5.7為三菌混合固態發酵培養基最佳初始pH值。

2.5 發酵溫度的選擇

在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養基初始含水量為80%、pH值為5.7、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、靜置培養4 d條件下，比較研究了不同的發酵溫度對乳酸菌固態混合發酵的影響。不同微生物生長所需的適宜溫度不同,LB生長適宜溫度為 37～42 ℃[10]，LA 生長適宜溫度為 35～37 ℃[8－9]，ST生長適宜溫度為40～42℃[11]。由圖5可以看出，LB在40℃時達到最大值3.2×109CFU/g，LA在37℃時達到最大值4.9×109CFU/g，ST則在42℃時達到最大值5.7×109CFU/g。通過綜合評分，選擇溫度40℃為三菌混合固態發酵的最佳發酵溫度。

圖5 發酵溫度對乳酸菌固態混合發酵的影響

2.6 正交試驗

以發酵后的活菌數為指標,在單因素試驗的基礎上，在玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、LB、LA和ST接種比例為1：1：1、靜置培養4 d的條件下，選擇接種量、培養基初始含水量、培養基初始pH值和發酵溫度4個因素進行L9(34)正交試驗（因素水平見表1），結果如表 2 所示。可以看出 RB＞RC＞RA＞RD，所以培養基初始含水量對于本試驗的影響最顯著，其次是培養基初始pH值、接種量，最后是發酵溫度。通過綜合評分，得出最優發酵方案為A2B3C3D2，即接種量10%、培養基初始含水量80%、pH值6.3、發酵溫度40℃。但是最優發酵條件并沒有出現在9組試驗中，為了證實理論分析，進行補充試驗。在此優化方案下進行乳酸菌固態混合發酵后，LB數達到3.0×109CFU/g,LA數達到 4.6×109CFU/g,ST 數達到 5.8×109CFU/g，都優于其他小組，表明最優發酵條件成立。

2.7 發酵產物常規營養成分測定(見表3）

由表3可以看出，發酵后的固態基質（玉米粉、麥麩和豆粕）中粗蛋白含量是發酵前的1.16倍，提高了基質的蛋白質水平，而且部分蛋白質轉化為菌體蛋白，改變了基質蛋白質的營養品質；氨基酸態氮含量是發酵前的6.94倍，可見乳酸菌的發酵作用能將基質中的大分子蛋白降解為動物更易消化吸收的小分子氨基酸，可明顯改善動物對基質的利用率[15]。此外，發酵后的固態基質中粗脂肪含量是發酵前的1.12倍，提高了基質的脂肪水平，能更好地滿足動物對必需脂肪酸等脂肪類物質的需求。

表2 正交試驗方案及結果

表3 發酵前后固態發酵培養基中營養成分的比較

3 結論

通過單因素和正交試驗優化了LB、LA和ST這三種菌的混合發酵條件,得到固態發酵的最佳條件為：固態基質中玉米粉：豆粕：麥麩=1：1：1、培養基初始含水量80%、pH 值6.3、接種量為10%，LB、LA和ST接種比例為1：1：1、發酵溫度40℃。在此最適條件下，LB 數為 3.0×109CFU/g,LA 數為 4.6×109CFU/g，ST 數為 5.8×109CFU/g。

LB、LA和ST混合發酵后,發酵產物中不僅含有大量益生菌,而且也使得發酵產物中粗蛋白質、氨基酸和粗脂肪等營養物質含量增多,使得混合發酵產物作為一種生物飼料產品的研制和產業化具有很好的前景。

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