混合菌發酵稻草室溫條件的研究

李明軒 耿春銀 張 敏

農作物秸稈是最豐富的木質纖維素資源[1]，稻草作為我國產量最多的秸稈飼料，消化蛋白質含量低，粗纖維含量較高，很大一部分的纖維素不能被畜禽類胃腸道消化分解，要靠體外的強酸、強堿以及特定的微生物來分解，以至于營養價值很低[2]。稻草資源在我國具有分布廣，產量大，價格低廉的特點，但是利用率很低。這是因為稻草主要由纖維素、半纖維和木質素組成，其木質素含量很低，但它緊緊的包裹在纖維素的表面，并且與纖維素、半纖維素有著較牢固的化學連接,這樣就使秸稈的利用率大大降低[3]。本試驗就是利用白腐菌先降解纖維素外圍的木質素，更有利于康氏木霉對纖維素的降解，試驗采用康氏木霉、白腐菌、酵母菌混合培養發酵稻草，提高了稻草利用率及其營養價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

康氏木霉(Trichodrma pseudokoning)由延邊大學農學院動物營養實驗室提供；

白腐菌 5.132（Fomes lignosus）購于中國科學院微生物研究所菌種保藏中心；

酵母菌（Yeast Bacteria）由延邊大學農學院動物營養實驗室提供。

1.1.2 培養基

CPDA培養基：馬鈴薯浸提液1 ml；葡萄糖20 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素 B1微量、瓊脂15 g，pH 值 6.0；

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g，水 1000 ml，121 ℃高壓蒸汽滅菌 30 min。

固體發酵培養基：稻草6 g、麩皮4 g，自然pH值，營養液6 ml；營養液構成：蔗糖22.8 g、(NH4)2SO410 g、K2HPO45 g、MgSO42.5 g、水 1000 ml。

1.1.3 主要試劑

①DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸顯色液）；②1%乙酸－乙酸鈉緩沖溶液（pH值為4.8）；

③1%CMC溶液：羧甲基纖維素鈉（CMC）1 g以pH值4.8醋酸緩沖液定容至100 ml。

1.2 方法

1.2.1 菌種間相容性試驗[4]

1.2.1.1 康氏木霉和酵母菌

酵母菌接種PDA培養基平板，再接種康氏木霉菌種于其上，另一PDA培養基平板上接康氏木霉菌種，作為對照。培養條件：28℃靜置培養5 d。

1.2.1.2 白腐菌與酵母菌

酵母菌接種CPDA培養基平板，再接種白腐菌種于其上，另一CPDA培養基平板上接白腐菌菌種，作為對照。培養條件：室溫下培養。

1.2.1.3 康氏木霉與白腐菌

將康氏木霉與白腐菌接入到同一PDA培養基平板上，28℃靜置培養5 d，觀察其生長情況，比較同一平板上兩種菌種的生長情況，為下一步混合發酵做參考。

1.2.2 發酵培養基優化試驗

采用正交試驗來確定康氏木霉、白腐菌與酵母菌混合發酵稻草秸稈飼料的最佳培養基。采用三因素三水平正交試驗方法，三水平為稻草：麩皮(A)、尿素(B，氮源%)、營養液(C,%)，正交試驗因素水平見表1。發酵前后測定原料中的羥甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白含量。

表1 L9(33)正交試驗因素水平

1.2.3 發酵條件優化單因素篩選試驗

1.2.3.1 發酵時間

按1 ml接種量（康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：1：1）接種于上述優化培養基中，在室溫的條件下分別培養 5、6、7、8、9、10 d 發酵結束后分別測定發酵產物中的羧甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白質含量。

1.2.3.2 接種量

分別按1、1.5、2、2.5和3 ml接種量（康氏木霉： 白腐菌：酵母菌=1：1：1）接種于上述優化培養基中，在室溫的條件下分別培養6 d，發酵結束后分別測定發酵產物中的羧甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白質含量。

1.2.3.3 接種比例

按1 ml接種量（康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：1： 1，1： 2： 2，1： 3： 3，1： 2： 1，2： 1： 2，3： 1： 3）接種于上述優化培養基中，在室溫的條件下分別培養6 d，發酵結束后分別測定發酵產物中的羧甲基纖維素酶活性、粗纖維和粗蛋白質含量。

1.2.4 最佳條件下的發酵試驗

在上述正交試驗和單因素篩選出的最佳條件下進行混合菌種發酵稻草的試驗。

1.2.5 測定指標

羧甲基纖維素酶（CMC）測定采用DNS還原糖測定法；粗纖維含量測定：采用酸-堿洗滌法(張麗英，2007)[5]；粗蛋白質含量測定：采用凱氏定氮法(張麗英，2007)[6]。

2 結果與分析

2.1 菌種兼容性試驗

2.1.1 康氏木霉與酵母菌

與對照組相比，康氏木霉在酵母菌做成的平板長得好，比較旺盛，但是生長蔓延得速度較慢，充分說明了酵母菌與康氏木霉之間不存在抑制作用，與史國翠(2011)[7]報道的一致，酵母菌利用分解培養基的營養物質，分解產物促進康氏木霉的生長。

2.1.2 白腐菌與酵母菌

白腐菌在有酵母菌的平板中比對照組的菌絲更濃密，更粗更壯，但蔓延的速度相對較慢，試驗表明酵母菌與白腐菌之間沒有拮抗作用并且互利共生，因為酵母菌能分解利用培養基中營養物質，降解的糖和其它的營養物質，促進白腐菌的生長，即使白腐菌生長得很好，菌絲潔白，粗壯，但白腐菌的生長仍然受到限制，菌絲在平板中蔓延的很慢，可能是因為酵母菌鋪滿整個平板，白腐菌沒有生長的空間。

2.1.3 康氏木霉與白腐菌

白腐菌的生長與康氏木霉比較相對較慢，康氏木霉先長滿整個平板，說明兩者之間可以兼容共生，但白腐菌絲生長多少受到一些抑制，也許因為康氏木霉生長的更快，爭奪了白腐菌絲的生長空間，使它無法生長，長滿整個平板需要較長的時間。

2.2 最優培養基的確定

通過三因素三水平的正交試驗確定了多菌種混合發酵稻草的最優培養基，結果見表2。

三因素三水平正交試驗結果極差（R）分析可以看出纖維素酶活性、粗蛋白和粗纖維優化條件一致，影響因素次序為：A>B>C，影響最大的是稻草與麩皮的比，其次是尿素的添加量，最后是營養液的添加量，從極差表中的數據綜合分析可以得出，混合菌種發酵稻草的最優培養基為A2B2C2，即稻草：麩皮=6：4,尿素添加量2%，營養液添加量60%。此時，發酵獲得纖維素酶活性、蛋白質都較高，粗纖維的含量最低。

2.3 發酵條件的優化單因素篩選

2.3.1 混發酵時間的確定

多菌發酵產纖維素酶和蛋白質合成都是隨著發酵時間變化呈現不同的變化趨勢，從圖1、圖2可以看出，酶活性和粗蛋白在發酵的第6 d均最高，粗纖維含量最低，此后繼續發酵結果則相反。因為菌體生長階段隨著時間的不同出現穩定期和最高生長期，菌種數量越多，產酶量就越大，蛋白含量越高，纖維素酶把纖維素降解之后的二糖或單糖，被酵母菌利用吸收轉化為菌體蛋白，來降低粗纖維的含量，發酵時間越長，菌種過了最高生長期，菌絲數量減少，從而使纖維素酶活力和粗蛋白含量降低，導致粗纖維含量增加。

2.3.2 混菌發酵接種量的確定

接種量對試驗的結果有一定的影響，從圖3、圖4可以看出，多菌接種量為2 ml時，纖維素酶活性和粗蛋白含量最高，粗纖維含量最低，這是因為接種量過少產酶量也減少，降解纖維素的能力就隨之下降，轉化的粗蛋白的含量也減少；當菌種過量，互相又競爭生長空間和養分，進而導致微生物菌群生長不好，也符合上述菌種兼容試驗的結果，故最適宜的接種量為2 ml。

表2 正交試驗結果極差分析

圖1 發酵時間對纖維素酶活性的影響

圖2 發酵時間對粗蛋白和粗纖維含量的影響

圖3 接種量對纖維素酶活性的影響

圖4 接種量對粗蛋白和粗纖維含量的影響

2.3.3 混菌發酵接種比例的確定

纖維素酶在水解纖維素產葡萄糖過程中，葡萄糖和纖維素二糖對纖維素酶有很強烈的反饋抑制作用，這就影響了纖維素的水解速度和程度[8]，若能將利用纖維素水解產物的菌種和分解纖維素酶的菌種混合發酵，就能更徹底，更快的分解纖維素。本試驗采用了康氏木酶、白腐菌和酵母菌的混合發酵，白腐菌能分解稻草中的木質素，為康氏木霉降解纖維素提供了便利，康氏木霉產生的纖維素酶將纖維素分解的纖維素二糖等糖類物質，酵母菌可以利用這些單糖、雙糖物質生長并將培養物中的無機氮轉化為菌體蛋白，從而使稻草的營養價值提高，粗纖維降低。從圖5、圖6可以看出康氏木霉： 白腐菌：酵母菌=1：2：1時，纖維素酶活性和蛋白質含量最大，粗纖維含量最低。

圖5 接種比例對纖維素酶活性的影響

圖6 接種比例對粗蛋白和粗纖維含量的影響

2.4 最優化條件的發酵試驗

通過正交試驗和優化單因素試驗，確定了康氏木霉、白腐菌、酵母菌混合發酵稻草的最佳條件為：稻草：麩皮6：4，尿素2%，營養液60%，自然pH值。混合菌種接種量為2 ml，接種比例（康氏木霉：白腐菌：酵母菌）1：2：1，培養6 d，在此條件下進行發酵試驗，試驗結果見表3。

表3 最優條件下發酵產物的粗蛋白和粗纖維含量(%)

從表3可以看出，在最優的條件下，發酵最終產物中的粗蛋白含量高于以上的任何條件，為18.59%，比發酵前提高了15.1個百分點。粗纖維含量也很低，為23.17%，比發酵前降低了21.39個百分點。

3 討論

微生物處理秸稈飼料的報道日益增多，其研究越來越受到關注，很多文獻說明混菌發酵的效果要好于單一菌種的發酵效果，薛泉宏等[9]研究了2種曲霉發酵產纖維素酶的情況，結果表明2種曲霉按一定比例接種較單菌發酵產酶大幅度提高。主要因為混菌之間有共生和營養作用，能克服發酵過程中產生的不利影響，增加發酵的效果。微生物發酵秸稈飼料產纖維素酶是一種利用天然資源的有效方式，為微生物資源開發提供廣闊的前景，極大地推動我國飼料和畜牧業發展。

本試驗用多種菌種混合發酵稻草，利用木質素將纖維素外圍包裹的木質素降解之后，促進了康氏木霉對纖維素的降解效果，分解之后的纖維素二糖和簡單的糖類物質被酵母菌吸收利用合成菌體蛋白，從而達到降解粗纖維的目的，試驗在室溫的條件下進行的，接近實際生產效果，但還是存在一定的差距，在今后的生產中要應用各種途徑和方法探索多菌發酵之間的拮抗和共生的關系，加強微生物發酵秸稈飼料工藝的研究。

4 小結

試驗結果表明，康氏木霉與酵母菌之間無拮抗作用，酵母菌與白腐菌互生共利白腐菌與康氏木霉之間存在競爭性，但通過混合菌種優化條件的篩選，能降低拮抗。混合菌發酵稻草最佳培養基為：稻草：麩皮=6：4，2%的尿素，營養液60%，自然pH值。混合菌種(康氏木霉：白腐菌：酵母菌=1：2：1)接種量為2 ml，培養6 d為最佳。

[1]孫芹英，葛春梅.白腐菌混合發酵產酶及對秸稈木質纖維素的降解研究[J].工業微生物,2009,10:13.

[2]廖雪義,代青,余海忠.多種混合發酵秸稈生產蛋白質飼料的研究[J].中國飼料,2009,16:8-14.

[3]王志,陳雄,王實玉.擬康氏木霉和白腐菌混菌發酵處理稻草秸稈的研究[J].可再生資源,2009,27(4):36-38.

[4]李智明.復合菌種發酵秸稈蛋白質飼料[M].成都理工大學,2006,5:29-34.

[5]張麗英.飼料分析及飼料質量檢測技術(3版)[M].北京:中國農業大學出版社，2007(10):52-56.

[6]張麗英.飼料分析及飼料質量檢測技術(3版)[M].北京:中國農業大學出版社，2007(10):67-70.

[7]史國翠.康氏木霉與酵母菌混合發酵處理稻草秸稈的研究[J].湖北農業科學，2011(4):1421-1422.

[8]張英.微生物混合發酵生產纖維素酶的研究進展[J].釀酒,2010,5:20-22.

[9]薛泉宏,司美茹,等.多元混菌發酵對纖維素酶活性的影響[J].工業微生物,2004(3):30-34.