攜帶BARF1基因的人胃上皮細胞株的建立*

李淑英,張 科,杜海軍,王 湛,慈雅麗,王新燕,周 玲,曾毅

2.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所腫瘤病毒室,傳染病預防控制國家重點實驗室病毒性腫瘤組,北京 100052

BARF1是EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)編碼的Bam HIA區域的早期裂解基因,是近年來確認的EBV新的致癌基因,在EBV陽性腫瘤發生、發展過程中可能起重要作用[1-3]。通過構建攜帶BARF1基因的真核表達載體,轉染人胃上皮細胞,G418篩選后,獲得穩定表達BARF1基因的人胃上皮細胞株,而探討BARF1基因對人胃上皮細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 引物設計與合成 根據GenBank提供的BARF1基因序列,設計擴增目的基因BARF1的特異性引物,并在引物兩端添加酶切位點,引物序列見表1。

引物設計后,委托上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 攜帶BARF1基因真核表達載體的構建與鑒定 提取B95-8細胞RNA(按試劑盒說明書操作)。RT-PCR擴增cDNA。以此cDNA為模板擴增目的基因BARF1,目的基因BARF1擴增產物與pUMT載體克隆反應(按試劑盒說明書操作)。堿裂解法提取質粒;對所提質粒進行PCR、酶切及測序鑒定(委托北京百泰克生物計劃有限公司測序)。

將上述質粒進行雙酶切,并回收產物BARF1片段(按試劑盒說明書操作)。用EcoRI和XbaI進行雙酶切真核載體pcDNA3.1(+)-his,并進行回收。將回收BARF1片段與pcDNA3.1(+)-his片段按表2連接,連接產物轉化感受態E.coli DH5α,在含有氨芐青霉素的LB平板中篩選,用含有氨芐青霉素的LB液體培養基培養,堿裂解法提取質粒;對所提質粒進行酶切鑒定。

表1 本研究中使用的擴增引物Table1 The primers used in this study

表2 真核載體 pcDNA3.1(+)-his與BARF1連接體系(20μ L)Table2 The vector pcDNA3.1(+)-his connected with the BARF1 gene(20μ L)

1.3 細胞培養 人胃上皮細胞GES-1培養在DMEM培養液中(添加10%滅活的小牛血清,100 u/mL青霉素和100 u/mL鏈霉素)。培養于37℃,5%CO2的溫箱中,每2～3d換液1次。

1.4 細胞的轉染、克隆及鑒定 用 lipofectamine2000介導,將pcDNA3.1(+)-his空載體及攜帶目的基因BARF1的真核表達載體轉染人胃上皮細胞GES-1(按試劑盒說明書操作)。用有限稀釋法進行克隆,轉染后第3d將細胞消化分散,按每孔200個細胞接入48孔細胞培養板,用含有300μ g/mL的G418培養液進行篩選,每 2-3d換1次液,長出抗性克隆后擴大培養。

將抗性克隆細胞擴大培養后,提取細胞RNA,RT-PCR鑒定BARF1基因的表達,所用引物如表1中BARF1#3與#4。

1.5 繪制細胞生長曲線檢測BARF1基因對細胞增殖的影響

1.5.1 細胞計數法繪制生長曲線 取生長狀態良好的細胞,采用一般傳代方法消化細胞,制成細胞懸液,使其濃度為1×103個細胞/mL。取24孔培養板,每孔接種濃度為1×103個細胞/mL 500μ L,每種細胞(未轉染細胞、轉染空載體細胞及轉染目的基因的細胞)分別接種4個復孔。每天取各孔細胞計數,測出每孔中的細胞總數,求出每組平均值,持續計數6d。將每天計數所得的細胞濃度標在對數坐標紙上,然后將各點連成曲線,即為生長曲線。

1.5.2 CCK-8法繪制生長曲線 取對數生長期的細胞,用0.25%胰蛋白酶(含有0.02%EDTA)消化單層培養細胞,用含10%血清的DMEM培養液配成單個細胞懸液,濃度為3×103個細胞/ml的細胞接種于96孔培養板中,每孔加入200μ L,每種細胞設置4個復孔;空白對照孔只加DMEM培養基。將培養板移入CO2孵箱中,37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養。分別在細胞培養24h、48h和72h后,每孔加入CCK-8溶液10μ L(注意在孔中不要有氣泡生成),37℃,繼續孵育 3h,用酶標儀測定450nm處的吸光度,記錄結果。以培養時間為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制出細胞增殖曲線。

1.6 統計學處理 以 Excel建立數據庫,應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析,所有數值以均數±標準差(±s)表示;組間計數資料采用χ2檢驗,計量資料采用t檢驗,以P＜0.05為差異有顯著性,以P＜0.01為差異有極統計學意義。

2 結 果

2.1 BARF1基因真核表達載體的構建與鑒定

2.1.1 細胞RNA提取 將所提RNA進行瓊脂糖凝膠電泳得到28S、18S和5S三條帶。圖1顯示B95-8是B95-8細胞提取的RNA,實驗提取 RNA完整,無明顯降解現象。

2.1.2 目的基因的擴增 以RT-PCR所得cDNA為模板擴增目的基因,經瓊脂糖凝膠電泳,得到大小約為666bp的片段,圖2,同預期結果一致。

2.1.3 BARF1基因的T-A克隆與鑒定 為了驗證目的基因是否已經被成功連接到pUM-T原核載體上,我們對提取的質粒進行了BARF1基因的擴增鑒定,經瓊脂糖凝膠電泳得到大小為524bp的片段,與預期片段大小相一致,說明BARF1基因已克隆到pUM-T載體。

2.1.3.1 雙酶切鑒定 為了進一步證實BARF1基因已克隆到pUM-T載體,我們對提取的質粒進行雙酶切,并對酶切產物進行電泳,瓊脂糖凝膠電泳結果,得到3個不同的片段,其大小分別為3.4kb(可能為未被切的質粒)、2.7kb(與pUM-T載體大小相一致)及666bp(與插入的目的基因大小一致)。

2.1.3.2 測序鑒定 將所提質粒測序后與Gen-Bank中的 B95-8細胞株的基因序列同源性為100%。

2.1.4 BARF1真核表達載體的構建與鑒定BARF1與真核表達載體pcDNA3.1(+)-his連接、轉化感受態E.coli DH5α,經氨芐青霉素抗性篩選后,對所提質粒進行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳得到5.4kb及666bp兩個片段,圖3。

圖3 真核質粒雙酶切鑒定Fig.3 Identified eukaryotic plasmid by double enzyme digestion

2.2 轉染細胞鑒定BARF1基因的表達 G418為新霉素類似物,可以殺死沒有其抗性的細胞,而我們構建的BARFl真核表達載體和空載體pcDNA(3.1)-his均具有neo抗性,所以通過G418可以篩選出陽性克隆細胞。約2w后即可看到有G418抗性克隆出現,而沒有成功轉染的細胞均已死亡。每種轉染細胞分別挑出3個單克隆擴大培養。

從陽性克隆細胞(包括BARFl轉染的細胞和空載體轉染的細胞)及未轉染細胞 GES-1中提取RNA,逆轉錄,以逆轉錄產物為模板 PCR擴增BARF1。擴增BARFl用表1中引物3與4,擴增長度為524 bp,圖4,Neg是以無菌雙蒸水為模板的陰性對照,B95-8是以B95-8細胞的cDNA為模板的陽性對照,1是GES-1細胞cDNA為模板的擴增,2是轉染空載體細胞cDNA模板的擴增,3,4,5分別代表轉染BARF1基因細胞的cDNA模板的擴增。

圖4 轉染細胞鑒定BARF1基因的表達Fig.4 Identified BARF1 gene for transfected cells

2.3 轉染細胞生長曲線的繪制

2.3.1 細胞計數法 將轉染了BARF1基因組細胞、對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞接種于24孔板,各組細胞同步化,使細胞處于同一個生長狀況后,分別以培養1,2,3,4,5,6d的4個重復孔細胞數的均數作圖,繪制生長曲線,可見:培養3d后,轉染了BARF1基因組的細胞數量及TPA刺激的轉染了BARF1基因組細胞數量,開始超過了對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞的數量,隨著培養時間的增加,這一差異越來越大。提示:轉染了BARF1基因的GES-1細胞及其TPA刺激組細胞生長速度比對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞加快,圖5。

2.3.2 CCK-8法 將轉染了 BARF1基因及其TPA刺激組細胞和對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞接種于96孔板,各組細胞同步化,使細胞處于同一個生長狀況后,分別以培養24h,48h,72h后的4個重復孔先后加入CCK-8后的OD值的均數作圖,繪制生長曲線,可見:各組細胞先后加入CCK-8后的OD值在細胞培養了1d后,轉染了BARF1基因及其TPA刺激組的OD值開始超過了對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞的OD值,隨著培養時間的增加,這一差異越來越大。提示:轉染了BARF1基因及其TPA刺激組細胞生長速度比對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞快,表3。

圖5 細胞計數法繪制各組細胞生長曲線Fig.5 The growth curve of different groups of cells detected by the method of cell counting

表3 通過CCK-8法計算不同培養時間細胞的數量(±s)Table 3 The quatitiesof different group cellsat different time by the method of CCK-8

表3 通過CCK-8法計算不同培養時間細胞的數量(±s)Table 3 The quatitiesof different group cellsat different time by the method of CCK-8

Note:Compared with the control groups,*P＜0.05,Compared TPAGES-1/BARF1 with GES-1/BARF1 group,△P＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h GES-1 0.86±0.28 1.12±0.30 1.28±0.33 GES-1/P cDNA3 0.92±0.36 1.18±0.41 1.23±0.41 GES-1/BARF1 1.48±0.21* 1.76±0.28 1.89±0.29*TPA-GES-1/BARF1 1.59±0.45*△ 1.88±0.29*△ 1.98±0.42*△

3 討 論

EB病毒是一種致瘤病毒,該病毒DNA以線性雙鏈的構型存在,基因組大小為172kb。BARF1是近年來確認的EBV新的致癌基因,其致癌作用日益受到關注。李友瓊等[4]將BARF1基因轉染胃癌細胞系SGC7910后,能夠全面增強胃癌細胞的腫瘤原性。

由于目前BARF1基因在胃癌發生發展中的確切作用尚不清楚,并且在體內研究某一單個基因較為困難,我們通過構建攜帶BARF1基因的真核表達載體pcDNA3.1(+)-his/BARF1,建立了穩定表達BARF1基因的人胃上皮細胞株,從而建立了BARF1基因致瘤的體外模型,可進一步研究BARF1基因在胃癌發生發展中確切作用。

本次研究采用的脂質體介導法轉染細胞,該方法具有較多優點:操作簡便,轉染效率比較高,對細胞類型運用范圍廣,對轉染的核酸類型和分子量有很高的包容性,細胞毒性小。其原理是陽離子脂質體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內,形成DNA-脂復合體,也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附,再通過融合或細胞內吞作用進入溶酶體。內吞后的DNA-脂復合體在細胞內形成的包涵體,在輔助脂質體二油酰磷脂已醇胺(DOPE)作用下,細胞膜上的陰離子脂質因膜的不穩定而失去原有的平衡擴散進入復合體,與陽離子脂質中的陽離子形成中性離子對,使原來與脂質體結合的DNA游離出來,進入細胞質,進而通過核孔進入細胞核,最終進行轉錄并表達。

G418是一種氨基糖類抗生素,其結構與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似,它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質合成,是穩定轉染最常用的選擇試劑。當neo基因被整合進真核細胞基因組合適的地方后,則能啟動 neo基因編碼的序列轉錄為mRNA,從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達,使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。

通過繪制細胞生長曲線發現,轉染了BARF1基因及其TPA刺激組的細胞,經過一定時間培養后,超過了對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞的增殖速度,隨著培養時間的增加,這一差異越來越大,3d后這一差異明顯,提示:轉染了BARF1基因及其TPA刺激組細胞生長速度比對照組正常GES-1細胞和空載體質粒轉染GES-1細胞加快,可能是BARF1基因可以促進細胞增殖的原因。

[1]Seto E,Yang L,Middeldorp J,et al.Epstein Barr virus(EBV)encoded BARF1 gene is ex pressed in nasophary ngeal carcinoma and EBV-associated gastric carcinoma tissues in the absence of lytic gene expression[J].J Med Virol,2005,76(1):82-88.

[2]Fio rini S,Ooka T.Secretion of Epstein Barr virus-encoded BARF1 oncoprotein from latently infected B cells[J].Virol J,2008,5(70):1186-1743.

[3]宋立兵,李雋,曾木圣,等.EB病毒編碼的BARF1基因在人支氣管上皮細胞惡性轉化和腫瘤形成中的作用[J].癌癥,2004,23(11):1361-1364.

[4]李友瓊,張雪怡,曾健,等.EB病毒BARF1基因表達對胃癌細胞株SGC7910生物學行為的影響[J].江蘇大學學報(醫學版),2009,19(3):214-219.