雞源性腸炎沙門氏菌的流行病學調查*

王 亮,張元鵬,張榮武,徐 彪,朱來華,肖西志,羅 欣,常維山

2.山東省檢驗檢疫技術中心,青島 266002;

3.山東省德州市陵縣畜牧局,德州 253500

沙門氏菌是重要的腸道致病菌,是一個很大的菌屬,其血清型超2 000個,我國已發現216個[1-2]。腸炎沙門氏菌是其中的一種,常可引起雞、鴨等禽類感染,更重要的是可引起食物中毒。據報道,日、美等發達國家發生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙門氏菌引起的,其中主要病原菌為腸炎沙門氏菌[3]。我國針對于雞感染腸炎沙門氏菌的報道不多,為了解我國雞群及雞產品是否有腸炎沙門氏菌及其感染的情況,我們進行了雞源性腸炎沙門氏的分離鑒定及全國血清學調查,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料來源 為2008年以來我校獸醫門診就診的病、死雛雞的肝臟或心臟。

1.2 細菌分離、鑒定 取病死雞的心臟、肝臟等臟器直接在DHL培養基上劃線分離,恒溫箱中37℃培養24h。選取中間黑色邊緣半透明的小菌落,再在麥康凱培養基上劃線分離。挑取無色透明的可疑菌落,進行純培養。取分離及純化培養的細菌,進行涂片、染色、鏡檢。

1.3 生化鑒定 參考以往的文獻做了如下生化試驗[3-4],在三糖鐵培養基上表面上進行劃線與并穿刺培養,同時接種葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、枸櫞酸銨鹽、V-P試驗 、吲哚、乳糖 、蔗糖 、硫化氫、尿素等微量發酵管進行生化試驗。

1.4 血清學鑒定 按照沙門氏菌診斷血清(60種)說明書(寧波天潤生物藥業有限公司),將臨床所分離的可疑沙門氏菌的培養物與沙門氏菌屬診斷血清進行凝集試驗,10min內出現凝集者為陽性。

1.5 PCR

1.5.1 16s和23s rRNA擴增與測序 用CTAB法[5]提取可疑腸炎沙門氏菌的DNA基因組,根據已發表的腸炎沙門氏菌16s和23s rRNA以及其他的文獻[6-7]設計特異性引物,對分離的可疑腸炎沙門氏菌進行PCR擴增。引用16s rRNA引物[8]P1:TCACGACTTACATCCTAC; P2: CTGCTATATCAGCACAAC。擴增的目的片段的長度為697bp。23s rRNA引物序列為 P1:CGGGGGTAGAGCACTGTT T; P2: GGT TTGGGGTACGAT TTGA。擴增的目的片段的長度為761bp。反應體系為:10×PCR Buffer 2.5μ L;25mmol/L MgCl2,2μ L;10mmol/L dNTPs 0.5 μ L;上下游引物各0.5μ L;Taq 酶 0.2μ L;滅菌三蒸水 18.3μ L;模版 0.5μ L。16S rRNA 反應條件為:94℃10min,94℃45s,52℃45s,72℃1min,72℃延伸10min,30個循環。23S rRNA反應條件為:94℃10min,94℃45s,57℃45s,72℃1min,30個循環,72℃延伸min。

1.5.2 熱激蛋白60(HSP60)序列的擴增 根據腸炎沙門氏菌P125109MOPA序列中的HSP60序列,設計一對引物 P1:CGCGACCGTACTGGCGCAG;P2:AACAGCAGCCACT TTCACGATG。擴增片段為556bp反應體系同上。反應條件為:94℃10min,94℃30s,60℃30s,72℃30s,72℃延伸7min,30個循環。

1.6 人工感染試驗 將所分離的腸炎沙門氏菌接種于5mL試管中,37℃震蕩過夜培養。對菌液稀釋至0.5麥氏濃度,接種于 1d的SPF雛雞5只,每只灌服300μ L,對照組不接種。從死亡的雞只中分離細菌,進行細菌學鑒定。

另接種1d齡商品蛋雛雞(海蘭褐公雛,購自泰安東岳種雞場),分組:將20只雛雞分成4組,1,2,3組分別按照1∶100、1∶1 000、1∶10 000比例稀釋,每只灌服300μ L菌液,第4組灌服300μ L生理鹽水作對照試驗。每1d觀察發病與死亡情況。

1.7 腸炎沙門氏菌凝集試驗

1.7.1 腸炎沙門氏菌凝集抗原的制備 參照有關文獻[9-11]將試驗步驟加以改進。①將分離株接種于LB肉湯,置37℃震蕩培養24h。用滅菌的生理鹽水洗滌2次,然后調節菌液濃度與3號麥氏比濁管相當(大約1×1010/mL)②菌液滅活:按菌液體積的0.6%加入甲醛溶液,置37℃震蕩孵育24h,然后做無菌滅活試驗確定細菌都被滅活。③抗原染色:將滅活的抗原按3%加入結晶紫染色液進行染色,充分搖勻,室溫放置48h。置4℃冰箱保存備用。

1.7.2 凝集試驗 根據參考文獻[6,9]進行凝集試驗。將攻毒的實驗雞只進行無菌采血。各吸取50μ L,與凝集抗原混合均勻,觀察凝集現象。

1.7.3 交叉試驗 用自制的凝集抗原與雞白痢沙門氏菌的陽性血清進行玻片凝集試驗,采集接種腸炎沙門氏菌的雞血,制備簡易的陽性血清與雞白痢凝集抗原進行玻片凝集試驗。

1.8 血清流行病學調查 本實驗室主要從山東、江蘇、安徽、河南、河北以及其他的一些省份,采集各個日齡的商品蛋雞血樣共計603份,分別進行玻片凝集試驗。從當地3個農貿市場采集四喜丸子1份,豬場1份,魚1份,鴨翅 1份,鴨爪1份,鴨腸1份樣品中分離細菌鑒定有無腸炎沙門氏菌污染。

1.9 藥敏試驗 對分離的兩株細菌,進行藥敏試驗測其MIC值。選取臨床常用的丁胺卡那、頭孢曲松、哌拉西林、阿莫西林和克拉維酸鉀、阿奇霉素、頭孢哌酮、克林沙星、粘桿菌素、土霉素、多西環素、痢菌凈、磷霉素、新霉素13種藥物,將初始濃度定為8 192μ g/mL。將細菌接種到3ml～5ml營養肉湯中,于37℃恒溫振蕩培養8h～10h。用麥氏比濁管調至0.5麥氏濃度。采用倍比稀釋法,測定單藥的MIC[12]。

2 結 果

2.1 細菌分離鑒定 根據培養特性和形態學特征,自11株份可以病料中,分離出3株可疑腸炎沙門氏菌。即sd1,sd2,sd3。

2.2 生化反應 三糖鐵培養基呈紅色,上層段為黃色,產生H2S,使培養基變黑。生化試驗結果見表1。

由表1可見該菌葡萄糖(+)、麥芽糖(+)、吲哚(-)乳糖(-)蔗糖(-)硫化氫(+)、尿素(-)、山梨醇(+)。枸櫞酸銨鹽(-)甘露醇(-)、V-P試驗(-)。

2.3 3株可疑菌株的血清鑒定結果 1號菌,O3,19(+);Hg,p(+);Hg(+);Hm(+),抗原式:3,9:g,p,m。2、3號菌相同,結果為,O3,19(+);O9(+);Hg,p(+);Hg(+);Hm(+),抗原式:3,9,19:g,m,p。1號菌根據考夫曼·懷特沙門氏菌屬抗原表鑒定為庫卡沙門氏菌,2、3號菌根據O9陽性判斷其為腸炎沙門氏菌[13]。選擇3號菌進行后續試驗。將3號菌命名為S.enteritidis SD3。

表1 臨床分離菌與腸炎沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌的生化試驗比較Table1 The comparison of biochemistry test among clinical strains,Salmonella enteritidis and Salmonella pullorum

2.4 PCR擴增 提取分離菌S.enteritidis SD3分離株染色體DNA,用設計的特異性引物擴增。擴增產物經0.8%濃度的瓊脂糖凝膠電泳。結果如圖1。圖1-A顯示,擴增出的目16s rRNA的片段長度約679bp與設計長度相同。圖1-B顯示,擴增出的23s rRNA片段長度約761bp與設計長度相同。圖1-C顯示,擴增出的 HSP60片段與設計長度558bp相同。

選取分離菌的經DNA測序和序列分析,表明該菌16s rRNA序列與雞腸炎沙門氏菌(序列號:AM933172)16s rRNA序列完全相同。23s rRNA序列與雞腸炎沙門氏菌(序列號:EU146953)23s rRNA序列100%相同。HSP60與AM933172序列同源性為100%。與鼠傷寒沙門氏菌同源性分別為99%(序列號:CP001363)。

2.5 攻毒結果 人工接種4d后,SPF小雞開始發病,5d死亡2只,6d死亡1只,7d死亡2只(總死亡率:100%)。從死亡的雞只中分離的細菌,與上述鑒定結果相同。商品蛋雛雞:三組6d死亡1只;7d死亡1只;第12d第 1、2組各死亡 1只(總死亡率:4/15)。采集11只幸存的攻毒實驗雞血清,7只凝集試驗陽性,陽性率63.6%。

圖1 PCR結果Fig.1 PCR product

2.6 交叉試驗結果 對腸炎沙門氏菌與雞白痢沙門氏菌的交叉免疫學試驗,顯示兩者雖屬于D群沙門氏菌,但是并沒有出現凝集現象,結果為陰性。

2.7 流行病學調查 用自制的凝集抗原與采自攻毒雞只的血清進行玻片凝集試驗,除對照組外,其余均發生凝集現象。對全國603份血樣進行的檢測,共有9份為陽性,其中2份強陽性。8株可疑沙門氏菌株均不能與腸炎沙門氏菌株陽性血清出現陽性凝集反應。

2.8 藥敏試驗結果 S.enteritidis SD3的MIC值為哌拉西林 64μ g/mL,丁胺卡那為 16μ g/mL,頭孢曲松為8μ g/mL,阿莫西林和克拉維酸鉀是125μ g/mL,阿奇霉素 16μ g/mL,頭孢哌酮 8μ g/mL, 克林沙星 4μ g/mL,粘桿菌素 64μ g/ml,多西環素 8 192μ g/ml,土霉素 256μ g/mL,磷霉素 512μ g/mL,痢菌凈16μ g/mL,新霉素256μ g/mL 。

3 討 論

3.1 本研究所用病料是從我校獸醫門診就診的病雞體內收集的,分離出到的2株沙門氏菌不能反應腸炎沙門氏菌的感染率,僅表明目前國內確有腸炎沙門氏菌感染。從我們試驗看,攻毒的雞只死亡率較低。試驗組雞只相對于對照組,采食量雖無明顯變化,但身體瘦小,拉稀糞這與其腸毒素作用有密切相關[14-18]。但是對SPF雞的致死率較高(死亡率:5/5),SPF雞的發病性較嚴重,可能與其飼養環境較好,與病原微生物不接觸,也可能與腸道微生態有關。

3.2 交叉試驗的結果顯示,本實驗室分離的這兩株菌與雞白痢沙門氏菌未見到明顯交叉凝集的現象,雖然這兩種細菌同屬于D群,可能存在這種交叉現象,但就本實驗室分離的菌來說,這種現象可以不被考慮。

3.3 在我們目前所做的流行病學調查表明,腸炎沙門氏菌流行還不像雞白痢那樣較為普遍,600多份的血清樣品檢出9份陽性,說明腸炎沙門氏菌在雞群中感染仍還不普遍。當然,這一調查主要是準對與蛋雞群的樣本檢測,至于其他雞群的情況,現在還不了解。

3.4 本實驗室從市場購買的禽類制品中沒有分離到腸炎沙門氏菌,這也證明了禽肉制品被其污染的幾率很低。針對感染率較低的情況,這是可能由于我國在蛋雞飼養過程中,經常使用定期使用抗菌藥物,因此規模化養雞場沙門氏菌感染并不嚴重(在本研究進行的同時,我們同時進行了雞白痢沙門氏菌血清學調查,陽性率低于1%),因此本研究所進行的腸炎沙門氏菌的血清學調查發現陽性病例較少。

3.5 同時對這兩株菌進行了藥敏試驗該菌對丁胺卡那、頭孢曲松、哌拉西林均敏感。這就可能是我國目前腸炎沙門氏菌未大面積流行的原因。

我國每年因為腸炎沙門氏菌引起的食物時有發生,并且常是群發性的中毒。腸炎沙門氏菌具有垂直傳播的特點,能夠在輸卵管和卵黃里分離到,因此食用未完全加熱至熟的蛋品可以導致人類食物中毒[2]。但是我國較少發生因食用禽蛋導致的腸炎沙門氏菌食物中毒,這與我國飲食習慣有關[18]。

[1]Keller L H,Benson CE,Krotec K,et al.Salmonella entritid is colonization of the reproductive tract and forming and freshly caid eggs of chickens[J].Infect Immun,1995,63:2243-2249.

[2]趙德明,王彩虹.雞腸炎沙門氏菌感染癥[J].中國獸醫雜志,1998,24(8):52-53.

[3]張艷紅,杜元釗,吳延功.腸炎沙門氏菌快速檢測方法的建立[J].中國動物檢疫,2002,19(7):25-28.

[3]馮國金,龍建勇.雞腸炎沙門氏菌病的病原分離與鑒定[J].中國家禽,2004,26(23):14-16.

[5]Sambrook J,Russell D W.Moolecular cloning:A laboratory manual[M].3rd ed.New York:Cold Spring HarborL aboratory Press,2002:68-75.

[6]李求春,焦新安,徐耀輝,等.雞白痢和腸炎沙門氏菌抑制差減文庫的構建與分析[J].揚州大學學報(農業與生命科學版),2007,28(1):1-4.

[7]蔣穎,劉軼,酈曉瓊,等.腸炎沙門氏菌特異性診斷方法的建立[J].揚州大學學報(農業與生命科學版),2007,28(3):6-8.

[8]Park Myeoneg-kyu,Choi Kyoung-seong,Kim Myeong-chul,et al.Differential diagnosis of Salmonella gallinarun and S.pullorum using PCR-RFLP[J].Veterinary Science,2001,2(3):213-219.

[9]李磊,婁興國,李永強,等.雞白痢沙門氏菌平板凝集抗原的制備[J].河南畜牧獸醫綜合版,2008,29(9):9-10.

[10]劉保全.獸醫生物制品學.北京:中國農業出版社,1995.

[11]世界衛生組織著.陸生動物診斷試驗和疫苗手冊.第五版.農業部獸醫局/中國動物衛生與流行病學中心譯,2007,787-795.

[12]孔繁德.德沙門氏菌快速檢測體系的建立與應用及其耐藥性分析研究[J].南京農業大學學報,2006:63-70.

[13]R.E.布坎南,N.E.吉本斯等.伯杰細菌鑒定手冊.第8版.中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組譯,1984,392-442.

[14]K Chopra.Cloning and Expression of the Salmonella Enterotoxin Gene[J].Journal of Bacteriology,1987,169(11):5095-5100.

[15]T S Wallis.Enterotoxin production by Salmonella typhim uriumstrains of different virulence[J].J.Med.Microbio1.21(1986):19-23.

[16]李鐵民,馮翠蘭,林崇瑜,等.傷寒沙門氏菌腸毒素基因突變株的構建[J].中國人獸共患病雜志,1999,15(5):12-14.

[17]劉富來.腸炎沙門氏菌及其毒素滅活研究[J].Animal Husbandry&VeterinaryMedicine,2005,137(18):16-18.

[18]黃建華,徐心晶,等.鼠傷寒沙門菌 stn基因突變株的構建與毒力檢測[J].解放軍醫學雜志,2001,26(3):219-221.