豬帶絳蟲蘋果酸脫氫酶基因的克隆表達及免疫學分析*

江 楠,席曉蘭,王 杰,戴佳琳,廖興江,黃 江

2.貴陽醫學院化學教研室,貴陽 550004;

3.貴陽醫學院法醫學教研室,貴陽 550004

豬帶絳蟲是常見的人獸共患寄生蟲,在我國病區多呈片狀分布,其成蟲寄生于人體小腸引起絳蟲病,幼蟲(囊尾蚴)寄生于人體皮下肌肉、腦、眼等處引起囊蟲病[1-2]。近年來,本課題組先后構建了3種常見的人體帶絳蟲成蟲cDNA質粒文庫,并獲得豬帶絳蟲1 171條UniGene,這些基因涉及到蟲體的結構、代謝、運動、物質轉運等多方面,我們期望通過進一步研究,篩選出具有應用價值的免疫診斷抗原或疫苗候選分子[3-4]。蘋果酸脫氫酶(MDH)是三羧酸循環酶系中的重要組成部分,同時也與天冬氨酸轉氨酶一起組成天冬氨酸-蘋果酸穿梭體,參與細胞內物質間的轉移,起到在胞漿和線粒體之間轉運蘋果酸和還原性平衡物的作用,另外在糖異生和糖酵解等方面也起著重要的作用[5-7]。因此,MDH適宜于篩選特異的抗寄生蟲藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清、文庫、質粒和菌株 豬帶絳蟲蟲體標本采自四川甘孜雅江,亞洲牛帶絳蟲病人、豬帶絳蟲病人及牛帶絳蟲病人血清取自糞檢陽性的帶絳蟲病人。豬帶絳蟲成蟲全長 cDNA質粒文庫的構建、EST測序及Unigene分析由北京華大基因有限公司合作完成。大腸埃希菌BL21/DE3及原核表達質粒pET-28a(+)由中山大學熱帶病重點實驗室惠贈。

1.1.2 主要試劑和工具酶 NdeⅠ、HindⅢ、Ex TaqTM酶 、dNTP、RNaseA 、T4 DNA 連接酶、分子量標準:DNA marker DL2000、DL15000均購自大連寶生物工程有限公司,DNA凝膠回收試劑盒、質粒DNA快速提取試劑盒購自賽百盛技術有限公司(中國北京),異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Promega公司(美國),Ni-NTA Agarose(Cat.No.30210)購自德國NOVEGN公司,丙烯酰胺、N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海伸友生物科技有限公司,低分子量蛋白分子量標準購自Fermentas公司(立陶宛),預染蛋白質分子標準購自 TaKaRa公司(日本),硝酸纖維素濾膜(PVDF)膜購自Millipore公司(美國),大鼠抗HIS標簽抗體購自鼎國生物技術有限公司(中國北京),辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗大鼠、抗人IgG(H+L)抗體、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自Boster公司(中國武漢)。

1.1.3 引物的合成和DNA的測序 基因擴增引物由Introvigen上海生物技術有限公司合成,重組質粒DNA的測序由英俊科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 豬帶絳蟲蘋果酸脫氫酶(Ts MDH)基因的識別 本實驗組已經成功構建了豬帶絳蟲成蟲cDNA質粒文庫[8]。將獲得的豬帶絳蟲unigene進行Blastx分析,獲得編碼豬帶絳蟲MDH基因的質粒,GenBank登陸號為GT227115,并通過瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(ExPASY,http://ca.expasy.org/)預測其理化性質。

1.2.2 Ts MDH基因的PCR擴增 根據已獲得的MDH編碼序列,利用 DNAClub和PCRdesign設 計 引 物 。 P1:5′-GGACATATGATGCCTGGACCTCTTAGGGTT-3′,帶 NdeⅠ酶切位點 ,P2:5′-GCGAAGCT TTCACT TGAAGGAGGAAAGA GC-3′,帶 HindⅢ酶切位點。

以豬帶絳蟲成蟲cDNA文庫MDH的質粒為模版,進行 PCR擴增,反應條件為:94℃5 min;94℃30 s;94℃1min,61℃1min,72 ℃1min,共35個循環;72℃10 min。PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳回收

1.2.3 重組原核表達質粒的構建及鑒定 將PCR產物和原核表達質粒 pET-28a(+)用 NdeⅠ和HindⅢ進行雙酶切后回收,連接、轉化入大腸埃希菌BL21/DE3感受態細胞,卡那霉素篩選陽性單克隆,對該陽性克隆提取質粒進行PCR,雙酶切和測序鑒定。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達 取50μ L培養過夜的陽性克隆菌液,加入到含有卡那霉素的5mL LB培養基中,37℃250 r/min振搖至吸光度(A600值)=0.4-0.6時,加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導表達5h(并做相應陰性對照)。離心收集菌體,在沉淀中加入100μ L 1×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣緩沖液,煮沸5-10min,13 000r/min 離心 1min,取上清 10μ L,進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 重組質粒的大量誘導和純化 按上述方法對陽性克隆進行大量的誘導表達,離心收集菌體,冰上超聲裂解,分別取上清和沉淀樣品處理后行SDSPAGE判斷該重組蛋白的可溶性。并收集上清,用0.45μ L濾膜過濾,參照鎳離子金屬螯合劑親和層析柱說明書進行蛋白純化,收集蛋白洗脫液,再將洗脫的目的蛋白在PBS透析液(pH=7.4)中4℃透析24h(期間換透析液 2-3次),并根據說明書,用Bradford[9]法對經過以上步驟獲得的重組蛋白進行蛋白定量,于-80℃保存備用。

1.2.6 重組蛋白的蛋白質印跡(Western blotting)分析 將純化的蛋白進行SDS-PAGE(12%)電泳,將凝膠上的蛋白轉移到PVDF膜上,BSA室溫封閉2h,再分別與亞帶、牛帶、豬帶絳蟲病人、感染豬帶絳蟲的豬血清、正常人血清、SD大鼠免疫血清及SD大鼠正常血清(按1∶200稀釋)孵育,4℃過夜;次日,PBS洗3次,每次5min,然后與辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗豬、羊抗鼠、兔抗人IgG(按1∶2 000稀釋)室溫孵育 1h,PBS洗3次,每次5min;二氨基聯苯胺(DAB)顯色至出現目的條帶,超純水終止反應。

2 結 果

2.1 MDH基因的識別和生物信息學分析 在已獲得的cDNA文庫Unigene中,經Blastx分析該基因全長1 343bp,編碼區為 1 78bp～1 173bp,編碼332個氨基酸,理論分子量是36459.2kDa,等電點是8.39。

2.2 原核重組載體的鑒定 將重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定,產物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,見圖1。結果顯示在1000bp左右有一清晰條帶,與目的基因預測大小基本相符,此外重組質粒的測序報告表明插入序列與理論序列一致,證明重組質粒構建成功。

圖1 重組質粒的雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant by digestion with NdeⅠand HindⅢ

2.2 蛋白純化結果 將構建好的重組質粒轉化到E.coli BL21/DE3中表達,SDS-PAGE電泳分析結果如圖2中顯示,大約在41kDa左右處出現目的條帶,與理論分子量基本相符。將蛋白進行純化,結果如圖中第7泳道所示,其位置與目的蛋白相符,證明目的蛋白純化成功。測得純化產物的蛋白濃度為0.32mg/mL。

圖2 重組質粒pET-28a(+)-MDH在大腸桿菌BL21/DE3的原核表達及其純化產物SDS-PAGE電泳分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product of pET-28a(+)-MDH

2.3 重組蛋白免疫原性鑒定 用純化蛋白免疫SD大鼠8周后的血清及正常大鼠血清與純化蛋白進行Western Blotting,結果見圖3,結果顯示重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識別,而不能被正常大鼠血清所識別。

圖3 Ts MDH重組蛋白免疫原性的Western blotting分析Fig.3 Western blot analysis of Ts MDH

2.4 重組蛋白免疫反應性鑒定 用感染豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲、牛帶絳蟲的患者血清及豬帶絳蟲感染豬的血清與純化蛋白進行 Western Blotting,結果均顯示出較清晰條帶,見圖4中第1、2、3、4泳道,而陰性對照血清即健康人血清,未出現蛋白條帶,見圖4中第5泳道。

圖4 Ts MDH重組蛋白免疫反應性的Western blotting分析Fig.4 Western blot analysis of Ts MDH

3 討 論

豬帶絳蟲在全世界分布很廣,在我國分布也很普遍。分子生物學技術的不斷發展,利用基因工程疫苗進行絳蟲病的診斷及預防已是備受關注的研究方向,而多種組合疫苗的聯合免疫,也是今后研制絳蟲疫苗的一個主要方向。要達到這個目的,篩選并克隆較多有用的基因就成為現階段本課題組的研究重點。蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH)普遍存在于動物、植物和細菌中等各種生物中,根據其輔酶的特異性和在細胞內的分布和生理功能的不同,MDH在不同生物中可分為不同的類型,即依賴于氧化型輔酶Ⅰ(NAD)的MDH和依賴于氧化型輔酶Ⅱ(NADP)的 MDH;位于胞漿的MDH和位于線粒體的MDH[10]。作為三羧酸循環酶系中的重要組成部分,催化了草酰乙酸和蘋果酸之間的相互轉換,同時也與天冬氨酸轉氨酶一起組成天冬氨酸-蘋果酸穿梭體,參與細胞內物質間的轉移,起到在胞漿和線粒體之間轉運蘋果酸和還原性平衡物的作用;在糖異生和糖酵解等方面也起著重要的作用,是細胞中不可缺少的酶。

本次實驗,我們通過生物信息學的相關軟件進行分析,預測重組蛋白理論分子量是41kDa,圖2的4、5、6、7泳道顯示的重組蛋白與預期的大小一致,且條帶較濃,表明重組蛋白獲得高效表達,同時純化的重組蛋白濃度達到0.32mg/mL,足以進行各種酶學實驗,可為該蛋白下一步研究奠定基礎。由于抗生物學物質的抗體容易制取,并具有高度特異性,因此抗體成為許多分析和制備生化方法的核心。Western-blotting就是以抗體-抗原沉淀反應為基礎的方法,可用于不同抗原的比較和定量,能檢測樣品中的微量成分和近似相對分子質量。既可以定性,又可以半定量[11-13]。圖3結果顯示重組蛋白可被重組蛋白免疫大鼠血清所識別,說明重組蛋白能夠刺激大鼠免疫系統產生相應抗體,具有免疫原性;圖4中重組蛋白能被豬帶絳蟲病人血清所識別,表明重組蛋白能夠與患者血清中的特異抗體反應,說明該重組蛋白具有免疫反應性;但因其還可與其他兩種帶絳蟲感染血清發生反應,證明其診+斷特異性不高,推測不能作為診斷候選分子,但其具有免疫活性的高效表達,也可推測Ts MDH是一個具有開發潛力的基因,而本實驗也為此基因重組蛋白的進一步研究,特別是免疫學方面的功能等各方面的研究奠定了基礎。

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