伯氏瘧原蟲再感染過程中樹突狀細胞表面分子表達水平的實驗觀察

劉英杰,潘艷艷,李 瑩,馮永輝,劉 軍,曹雅明

2.中國醫科大學免疫學教研室,沈陽 110001

瘧疾是一種全球高發的原蟲感染性疾病。在瘧疾流行區,盡管多數人群體內存在一定水平的特異性抗體,但再感染的發生也普遍存在[1]。瘧原蟲對宿主免疫系統產生的抑制效應是導致再感染發生的主要因素之一[2],其中包括瘧原蟲對樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)成熟和功能的抑制[3-4]。

DCs是活化初始T細胞的唯一抗原提呈細胞,在啟動固有免疫應答和協調適應性免疫應答建立過程中發揮橋梁和紐帶作用。CD80、CD86和MHC-Ⅱ等表面分子表達是DCs成熟的標志,上調這些分子及CD40的表達是介導 Thl細胞應答建立的前提[5-7]。研究顯示,夏氏瘧原蟲初次感染早期,脾DCs可選擇性吞噬瘧原蟲感染的紅細胞,然后加工并提呈瘧原蟲抗原給CD+4T細胞,進而誘導保護性Thl細胞免疫應答的建立,然而一旦宿主產生適應性免疫,DCs的功能迅速下調[6]。而體內存在一定水平抗體的人群在發生再感染后是否影響DCs的功能目前尚不清楚。

我們新近的研究發現,伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei ANKA,PbA)感染的DBA/2小鼠早期根治性治療后90d,其血清中仍存在一定水平的特異性抗體。為此,我們在其初次感染后90d時進行再感染,然后對脾DCs表面相關分子表達水平進行檢測和功能分析。

1 材料與方法

1.1 小鼠、瘧原蟲和實驗感染 雌性,6～8w齡DBA/2小鼠(購自中國醫學科學院實驗動物研究所)經腹腔接種1×106PbA寄生的紅細胞(日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈)。小鼠經尾靜脈采血,制備薄血膜,吉姆薩染色,光學顯微鏡鏡檢計數紅細胞感染率。

1.2 藥物治療和小鼠再感染 初次感染后3d,開始經口給藥(氯喹 90mg/kg,青蒿琥脂片 60mg/kg,分別購自上海中西藥業有限公司和桂林南藥股份有限公司),每d 1次,連續3d;對照組小鼠給予等量的生理鹽水。待初次感染后90d,小鼠用1×106PbA再次攻擊感染。同時以初次感染小鼠作對照。

1.3 流式細胞儀檢測脾細胞中表達相關表面分子DCs和活化性T細胞的百分率 無菌取出再感染前(0d)和再感染后第1d、3d和5d小鼠脾臟,常規方法制備脾細胞懸液,用0.17 mol/L NH4CL裂解紅細胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI 1640調整脾細胞終濃度為1×107/mL。每份樣品中表達每種表面分子的DCs和活化性T細胞檢測均用雙色分析,同時另設陰性對照管。在預先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細胞儀專用染色管中加入新鮮制備的脾細胞懸液0.1ml,然后將抗CD11c-FITC和抗CD80-PE、抗 CD11c-FITC 和抗 CD86-PE、抗CD11c-FITC和抗 CD40-PE、抗CD11c-FITC和抗MHC-II-PE、抗CD4-FITC和抗CD69-PE分別加入上述不同染色管中,用含1%FCS的PBS洗滌兩次并懸浮于 500μ L PBS中,流式細胞儀(Becton Dickinson,USA)進行檢測。

抗MHC-II-PE購于eBioscience公司,其余單克隆熒光標記抗體和封閉抗體均購于BD Pharmigen公司。

1.4 統計學處理 應用SPSS11.5統計學分析軟件,Student's-t檢驗和單因素方差分析比較各組均值的顯著性差異,P＜0.05為差異顯著(結果為3次結果的均值)。

2 結 果

2.1 小鼠再感染前后不同時間點脾細胞中CD80+DCs的百分率 如圖1所示,再感染前小鼠脾細胞中CD80+DCs的百分率與未感染的正常小鼠基本相似;但與未感染的正常小鼠或再感染前小鼠相比,再感染后第3d小鼠脾細胞中CD80+DCs百分率明顯增加(P＜0.01),此后還有進一步升高的趨勢。由于瘧原蟲感染的紅細胞也于感染后第3d出現在外周血中(數據未顯示)。提示,CD80+DCs百分率的升高系由瘧原蟲刺激所致。

圖1 小鼠再感染前后不同時間點脾細胞中CD80+DCs的百分率C:正常未感染小鼠;PbA:再感染小鼠**P＜0.01,表示與正常或再感染前小鼠相比Fig.1 Percentage of CDc11+CD80+DCs in spleen cells from miceatdifferent time points after reinfection with PbAC:represent control(noninfected)mice;PbA:represent mice reinfected with PbA**P＜0.01,compared with control(noninfected)mice or pre-reinfected mice(0 d)

2.2 小鼠再感染前后不同時間點脾細胞中CD86+DCs的百分率 如圖2所示,再感染前小鼠脾細胞中CD86+DCs的百分率與未感染的正常小鼠基本相似;但與未感染的正常小鼠或再感染前小鼠相比,再感染后第3d CD86+DCs百分率明顯增加(P＜0.01);再感染后第5d的水平與第3d的基本相當。

2.3 小鼠再感染前后不同時間點脾細胞中CD40+DCs的百分率 如圖3所示,與未感染的正常小鼠相比,再感染前小鼠脾細胞中CD40+DCs的百分率稍有下降,但沒有顯著差異(P＞0.05);與未感染的正常小鼠或再感染前小鼠相比,再感染后第3d小鼠脾細胞中CD40+DCs百分率明顯增加(P＜0.01);并在再感染后第5d進一步升高。

2.4 鼠再感染前后不同時間點脾細胞中MHC-II+DCs的百分率 如圖4所示,與未感染的正常小鼠相比,再感染前小鼠脾細胞中MHC-II+DCs的百分率稍有下降,但沒有顯著差異(P＞0.05);與未感染的正常小鼠或再感染前小鼠相比,感染后第3d小鼠脾細胞中MHC-II+DCs百分率明顯增加(P＜0.05);并且在再感染后第 5d進一步升高(P＜0.01)。

圖4 小鼠再感染前后不同時間點脾細胞中MHC-II+DCs的百分率C:正常未感染小鼠;PbA:再感染小鼠*P＜0.05和**P＜0.01,表示與正常或再感染前相比Fig.4 Percentage of CDc11+MHC-II+DCs in spleen cells from mice at different time points.after reinfection with PbAC:represent control(noninfected)mice;PbA:represent mice reinfected with PbA*P＜0.05 and**P＜0.01,compared with control(noninfected)mice or pre-reinfected mice(0 d)

2.5 小鼠再感染前后不同時間點脾T細胞中活化性T細胞的百分率 如圖5所示,與未感染的正常小鼠相比,再感染前小鼠脾T細胞中活化性T細胞(CD4+CD69+)的百分率與其基本相似;但再感染后第1d出現了有意義的升高(P＜0.05),這表明,再感染前小鼠體內可能存在一定數量的記憶性 T細胞,當再次感染時這些細胞迅速活化。而此后活化性T細胞百分率進一步升高,則提示除記憶性T細胞活化外,可能又有一些初始T細胞逐漸活化。

3 討 論

我們新近的研究發現,聯合應用氯喹和青蒿琥脂片對PbA感染早期小鼠進行根治性治療,待90d后再感染時,小鼠僅出現短暫且低水平的蟲體血癥。再感染后第1d IFN-γ開始升高,再感染后第3d,不僅IFN-γ繼續升高,而且TNF-α和特異性IgG水平也顯著升高;并且再感染前小鼠血清中存在一定水平的特異性IgG。再感染后第1d IFN-γ的升高和再感染前特異性IgG的存在可能與初次感染后產生的免疫記憶有關;但再感染后第3d,IFN-γ、TNF-α和特異性IgG出現極為顯著的升高,則提示,小鼠針對再感染產生了明顯的Th1應答和特異性體液免疫應答。

圖5 再感染前后不同時間點脾T細胞中活化性T細胞的百分率C:正常未感染小鼠;PbA:再感染小鼠;*P＜0.05和**P＜0.01,表示與未感染的正常小鼠相比;P＜0.01,表示與再感染前小鼠相比Fig.5 The percentage of actived T cells in spleen T cells from mice atdifferent time points after reinfection with PbAC:represent control(noninfected)mice;PbA:represent mice reinfected with PbA;*P＜0.05 and**P＜0.01,compared with control(noninfected)mice;P＜0.01,compared with pre-reinfected mice(0 d).

作為活化初始 T細胞的唯一抗原提呈細胞,DCs是啟動固有免疫應答和協調適應性免疫應答建立不可或缺的關鍵性細胞。致死型約氏瘧原蟲感染C57BL/6J小鼠可完全抑制其DCs的功能,導致蟲體血癥迅速升高和小鼠死亡,而非致死型約氏瘧原蟲感染,DCs可發揮正常的抗原提呈功能并刺激Th應答建立進而抑制蟲體血癥快速升高,使宿主存活,將非致死型約氏瘧原蟲感染小鼠的DCs過繼轉移給致死型約氏瘧原蟲感染的小鼠,可使其控制蟲體血癥并存活[8]。在致死型約氏瘧原蟲感染過程中,與易感的BALB/c小鼠相比,抵抗的DBA/2小鼠其表達CD80、CD86、MHC-Ⅱ和CD40等表面分子的成熟DCs數量明顯高于BALB/c小鼠,并能抑制急性期蟲體血癥快速升高,且全部存活,而BALB/c小鼠蟲體血癥升高極為迅速,并于感染后6d全部死亡,進一步的實驗也證實,DBA/2小鼠的DCs在瘧原蟲感染紅細胞的刺激下可明顯促進CD4+T細胞增殖能力和IFN-γ分泌水平[9]。這些結果充分證明,瘧原蟲既可抑制DCs成熟,但也能刺激高表達 CD80、CD86、MHC-Ⅱ和 CD40成熟的DCs產生,并藉此啟動Th應答,進而影響瘧疾的感染結局。

在此,我們的研究顯示,再感染后第3d,脾DCs表達CD80、CD86、MHC-Ⅱ及CD40分子開始明顯增強,同時活化的 T細胞百分率也顯著增加,并且我們前期研究已發現IFN-γ和TNF-α在再感染后第3d也出現非常顯著的升高。PbA是導致嚙齒類動物發生重癥腦瘧的病原體,具有較強毒力[10],而DCs的成熟和功能的發揮既與蟲株毒力相關也受蟲體血癥水平所影響[4,8,11],但我們的結果則表明,雖然PbA具有較強毒力,但在一定限度的蟲荷狀態下仍可誘導DCs的成熟和功能的發揮,早期根治性治療后,宿主存在一定水平的抗體也未對DCs的功能產生明顯的影響。雖然我們的模型系統不能全面精準地反映人類瘧疾再感染的全部特征,但也可為研究人類抵御瘧疾再感染的免疫應答機制提供可借鑒的信息和線索。

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