副豬嗜血桿菌云南本地株的分離及鑒定

紀文清,胡永貴,楊貴樹

(1.墨江縣畜牧獸醫局畜牧工作站,云南 墨江 654800; 2.云縣畜牧局,云南 云縣 675800;3.云南農業大學動物科學技術學院,云南 昆明 650201)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的多發性漿膜炎和關節炎。病豬表現有體溫升高(40℃以上),精神沉郁,食欲下降,呼吸困難,被毛粗亂,皮膚發紅甚至發紫,消瘦,呼吸困難,關節腫大,跛行等。關節腔內滲出大量纖維素性液體。該病于 1910年由Glasser首次報道,因此又稱為格拉斯氏病(Glasser's disease),呈世界性分布,我國也從部分規模化豬場中分離到該病菌[1]。在我國當前流行的優勢血清型主要為 4、5、12、13型[2,3,4]。

副豬嗜血桿菌通常只感染豬,有較強的宿主特異性,主要通過空氣、豬與豬之間的接觸及排泄物進行傳播,傳染源為病豬和帶菌豬。通常情況下,母豬和育肥豬是副豬嗜血桿菌的攜帶者,可影響 2～4周齡豬。主要在斷奶后和保育期間發病,感染高峰為 4～6周齡的豬。副豬嗜血桿菌病的發病率為 10% ～15%,嚴重時病死率可達 50%[5]。為預防該病,國內外雖然研制了各種類型的基因工程菌苗與多價滅活菌苗,但由于副豬嗜血桿菌血清型眾多,各個地方的流行菌株各不相同,各個血清型之間的交叉保護性不高,菌苗的免疫效果并不理想[6],給養殖業造成了巨大經濟損失。鑒于本省未見該菌分離的相關報道,本研究通過對云南本地流行株進行分離鑒定,為該病的防制和進一步研究奠定一定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

采集于具有副豬嗜血桿菌病典型臨床癥狀的仔豬肺臟。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、木糖、尿素、明膠、過氧化氫等,所有試劑均由云南農業大學動物醫學實驗教學中心提供。按常規方法制備備用。

1.2 試驗方法[7]

1.2.1 病原菌分離培養

采用直接分離培養法,將病變肺臟剪斷以新鮮切面在培養基上涂抹一點后,進行常規劃線分離,置 37℃恒溫箱培養24～48 h后,挑取可疑菌落作純培養。挑取純培養物接種在普通瓊脂上,觀察是否生長。同時挑取純培養菌株接種在鮮血瓊脂上,然后用葡萄球菌在鮮血瓊脂上劃線,觀察有無衛星現象。

1.2.2 鏡檢

將分離菌株純培養物直接涂片,革蘭氏染色,鏡檢。

1.2.3 生化試驗鑒定

1.2.3.1 糖發酵試驗 將分離菌株按常規方法分別接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、木糖培養基中,37℃培養 24～48 h,觀察其對各種糖的利用情況并記錄結果。

1.2.3.2 尿素酶試驗 將分離菌株劃線接種于尿素酶培養基斜面上,37℃培養 24～48 h,觀察其反應情況。培養基變粉紅色至紅色者為陽性反應,不變者為陰性反應[2]。

1.2.3.3 靛基質(Imdole)試驗(吲哚試驗) 將分離菌株接種于蛋白胨水培養基中,37℃培養 72 h后,先加少量乙醚或二甲苯,搖動試管以提取和濃縮靛基質,待其浮于培養液表面后,再沿試管壁緩緩加入Kovacs氏試劑數滴,在接觸面呈玫瑰紅者為陽性反應,反之為陰性反應。

1.2.3.4 過氧化氫酶試驗 將過氧化氫溶液直接加入副豬嗜血桿菌生長的斜面上,觀察氣泡的產生。有氣泡產生為陽性,無氣泡產生為陰性。

1.2.3.5 精氨酸水解酶試驗 將細菌接種于精氨酸水解酶培養基中,細菌使精氨酸降解為鳥氨酸、氨和二氧化碳,氨使培養基顯堿性。指示劑呈紅色為陽性。

1.2.3.6 X因子、V因子需要試驗 挑取純培養菌株接種2%月示瓊脂平板上,再分別貼上浸漬有 X、V、X+V因子的圓形濾紙片。如果只有含 X+V因子的紙片周圍有菌落生長,則表明該菌株既依賴 X因子又依賴V因子。如果只有含V、X+V因子的紙片周圍有菌落生長,則表明該菌株只依賴V因子不依賴 X因子。如果只有含 X、X+V因子的紙片周圍有菌落生長,則表明該菌株只依賴X因子不依賴V因子[8]。

1.2.3.7 氧化酶試驗 取潔凈濾紙 1小塊,沾取純培養菌株少許,然后加 1%鹽酸四甲基對苯二胺或 1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑。細菌在與試劑接觸 10 s內呈深紫色為陽性。為保證結果的準確性,分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。

2 結果

2.1 培養特性

取病變肺臟接種于巧克力瓊脂培養基,37℃培養 24～48 h后可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長。普通瓊脂培養基上不生長。挑取典型菌落接種于鮮血培養基上,同時在上面接種金黃色葡萄球菌,置 5%～10%CO2培養箱中,37℃培養 24h,發現越靠近葡萄球菌菌落處,該分離菌菌落生長越大,而越遠離葡萄球菌菌落處,該分離菌菌落生長越小,甚至無菌落(見圖 1)。

圖 1 鮮血瓊脂培養物

2.2 分離菌株染色鏡檢結果

挑取純培養后生長出的菌落經染色后見到革蘭氏陰性的細小桿菌。菌體形態多樣,以纖細桿狀者居多,間有長而彎曲絲狀菌體,個別呈兩極濃染的球桿狀(見圖 2)。

圖 2 16×100,巧克力瓊脂培養物,革蘭氏染色

2.3 生化試驗鑒定結果

分離菌株能發酵葡萄糖、乳糖,產酸不產氣,不發酵蔗糖、木糖、甘露醇,不產生靛基質,不分解尿素,不分解精氨酸,過氧化氫酶陽性,氧化酶陰性。生化試驗結果見表 1。

根據細菌的培養特性、鏡檢結果和生化試驗鑒定,該次分離菌株為副豬嗜血桿菌。

3 討論

(1)由于副豬嗜血桿菌有較高的培養要求,其生化實驗的關鍵是特殊培養基的選擇。血清、NAD等成份的加入可以保證副豬嗜血桿菌的培養成功,但是必須保證加入的成份不改變生化試劑的pH值等生化特性。

(2)X因子是血紅蛋白中的血紅素及其衍生物,含鐵卟啉,121℃高溫下 30min不被破壞,是細菌合成細胞色素、細胞色素氧化酶、觸酶和過氧化物酶等的輔基。嗜血桿菌屬的多數細菌生長需要供給X因子,但分離菌株不需要 X因子,與副豬嗜血桿菌相符。V因子為輔酶I即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP),是細菌呼吸過程中起遞氫作用的兩種脫氫輔酶,副豬嗜血桿菌自身不能合成V因子,在分離培養時,培養基中應加入V因子。

(3)過氧化氫酶是一種以正鐵血紅素作為輔基的酶,所以測試菌所生長的培養基不可含有血紅素或紅血球。并且在試驗中不能使用金屬器具,如鉑耳等。

(4)副豬嗜血桿菌十分脆弱,分離培養菌株在 4℃冰箱中保存 3 d即可死亡。病料中的副豬嗜血桿菌也只能存活6 h,給分離培養帶來一定的困難。因此需在患豬剖殺或死亡后及時進行病原分離。副豬嗜血桿菌在鼻腔和氣管中分離率較高,肺臟中極少分離到。本試驗是從具有典型病理變化的肺臟中經常規分離到該病原,由此證明,具有典型病變的肺臟也可作為本病原的分離培養病料。

表 1 副豬嗜血桿菌生化試驗結果

(5)對于豬的呼吸道疾病,如支原體肺炎、繁殖與呼吸綜合征、豬流感、偽狂犬病和豬呼吸道冠狀病毒等感染時,副豬嗜血桿菌的存在可加劇疾病的臨診表現。另外,一些最新報道指出,副豬嗜血桿菌可能還是引起纖維素性化膿性支氣管肺炎的原發因素[9]。

(6)對于該病的診斷及防治除了要有一套臨床診斷方法外,最重要的是在于平時采取綜合防制措施:加強生物安全防范意識,規模化豬場要堅持自繁自養、全進全出的原則,嚴格控制人員的流動,杜絕外來人員的參觀,進出物品嚴格消毒;建立良好的飼養管理環境,豬舍保持清潔衛生,按時消毒,保持舍內通風;發病時要用大劑量抗生素治療,并進行全群藥物預防,控制病原,減少應激。

(7)疫苗是預防副豬嗜血桿菌病最為有效的方法之一,但由于副豬嗜血桿菌具有明顯的地方性特征,而且不同血清型菌株之間的交叉保護率很低。因此主要用當地分離的菌株制備滅活苗,可有效控制副豬嗜血桿菌病的發生[10]。

[1] 陳溥言.獸醫傳染病學[M].第五版·北京:中國農業出版社,2006:264-265.

[2] 周迎芳,李逢慧,羅超,等.副豬嗜血桿菌研究現狀[J].中國畜禽種業,2008(11):59-61.

[3] 方泉明,黃冬艷.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及其對小白鼠致病性試驗[J].江西畜牧獸醫雜志 ,2008(5):12-14.

[4] 宋鳳香,閆振貴,姜世金.副豬嗜血桿菌的分離鑒定和藥敏試驗研究[J].山東畜牧獸醫 ,2008(5):10-12.

[5] 賈愛卿,李春玲,王貴平,等.副豬嗜血桿菌毒理因子的研究現狀[J].Animal Husbandry＆Veterinary Medicine,2008,40(3):92.

[6] 鐘登科,魏建超,張訓海,等.副豬嗜血桿菌安徽株分離鑒定與藥敏試驗[J].養豬,2008(1):51-52.

[7] 陸承平.獸醫微生物學[M].第四版·北京:中國農業出版社,2007:258-261.

[8] 陳天壽.微生物培養基的制造與應用[M].北京:中國農業出版社,1995:384-467.

[9] 張婷,甘源,李賀俠,等.副豬嗜血桿菌病的診斷[J].今日畜牧獸醫,2008(9):28-29.

[10] 蔡旭旺,劉正飛,陳煥春,等.副豬嗜血桿菌的分離培養和血清型鑒定[J].華中農業大學學報,2005(1):55-58.