乳腺癌細胞腫瘤標記物表達及其與臨床病理特征相關性研究

王瑾 鄭芹 楊惠玲

乳腺癌細胞腫瘤標記物表達及其與臨床病理特征相關性研究

王瑾 鄭芹 楊惠玲

目的探討腫瘤標記物14-3-3σ、Akt和p27Kip1蛋白在乳腺癌中的表達及其與臨床病理特征及Her-2的相關性。方法選取43份乳腺癌石蠟標本和10份正常乳腺組織標本，采用免疫組織化學技術( SABC )檢測組織中14-3-3σ、Akt和p27Kip1蛋白的表達，結合臨床資料和隨訪資料，進行回顧性研究，作出評估。統計學采用 Wilcoxon 秩和檢驗或 Kruskal-Wallis 檢驗，并采用 Kaplan Meier 法進行單因素生存分析。結果14-3-3σ、Akt可表達于細胞胞漿，而p27Kip1蛋白可表達于細胞胞漿或（和）胞核。胞漿14-3-3σ、Akt或p27Kip1蛋白胞漿表達均與淋巴結轉移和臨床分期呈正相關（P ＜ 0.01或P ＜ 0.05），并提示生存相對較差，p27Kip1蛋白胞漿錯誤定位的患者預后不良。Her-2蛋白可能對PI3k-Akt和p27Kip1通路參與乳腺癌致病起到一定作用。結論14-3-3σ、Akt或p27Kip1蛋白可作為判斷乳腺癌淋巴轉移和預后評估的有效指標。

乳腺癌；腫瘤標記物；14-3-3σ 蛋白；Akt 蛋白；p27Kip1蛋白

乳腺癌(breast cancer)是嚴重威脅婦女健康的一種惡性腫瘤。目前，乳腺癌發病率已躍居我國婦女癌癥發病首位[1]。以癌基因( oncogene )或抑癌基因( tumor suppressor gene )作為腫瘤標記物已取得很大進展，它通過檢測各種癌基因和突變的抑癌基因及其產物，為腫瘤的診斷和進一步治療提供依據。14-3-3σ 蛋白是一種分子伴侶，Akt 蛋白是一種蛋白激酶，p27Kip1蛋白是細胞周期負調控因子。不同的研究表明它們的表達與腫瘤的發生發展存在密切關系，并且它們之間有相互調節和(或)制約作用。本研究應用免疫組化法對Akt、p27Kip1及 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌組織中的表達情況進行檢測，并對其與乳腺癌臨床病理特征的關系及生存時間進行分析，以探討其在乳腺癌的發生和發展中的作用。

資料與方法

一、一般資料

篩查中山大學腫瘤防治中心2002年全年乳腺癌患者的資料，從中選擇了43例根治性手術切除的乳腺癌石蠟標本；另外選取10例癌旁正常乳腺組織石蠟切片作對照。病例選取的條件包括：患者術前均未行放、化療，術后均有明確的病理學診斷；年齡27 ～ 73歲，中位年齡47.0歲。根據2002年國際抗癌聯盟 （UICC）的TNM分期法：T1（腫瘤最大徑≤2 cm）11例，T2（腫瘤最大徑＞ 2 cm，但≤5 cm）17例，T3（腫瘤最大徑＞ 5 cm）12 例，T4[任何大小腫瘤，直接擴散到胸壁和皮膚（胸壁包括肋骨、肋間肌和前鋸肌，不包括胸?。3例；N0（無區域淋巴結轉移）20例，N1-3（有同側或對側區域淋巴結轉移）23例；所取標本均無遠處轉移。Ⅰ期6例，Ⅱ期 （Ⅱa+Ⅱb）26例，Ⅲ期 （ Ⅲa+Ⅲb+Ⅲc ）11例。

二、方法

Akt鼠抗人抗體購自 Cell Signaling 公司，p27Kip1兔多抗抗體及14-3-3σ山羊多抗抗體購Santa Cruz 公司，二抗及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

標本經4﹪甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片，免疫組化 SABC 法檢測實驗步驟按說明書進行?？乖捎酶邷馗邏盒迯?，用已知的陽性乳腺癌切片作陽性對照，用 PBS 取代一抗作陰性對照。

三、結果判讀標準

14-3-3σ、Akt蛋白陽性著色為粗細不一的棕黃顆粒，主要定位于腫瘤細胞胞漿中；p27Kip1定位于腫瘤細胞核和（或）胞漿。染色按陽性細胞數占腫瘤細胞的比例進行分級[2-4]。Akt陽性細胞數 ＜ 10﹪為（-），10﹪ ～ 50﹪為（+），＞ 50﹪為（+ +）；P27Kip1陽性細胞數＜ 5﹪為（-），5﹪ ～ 50﹪為（+），＞ 50﹪為（+ +）；14-3-3σ 陽性細胞數 ＜ 10﹪為（-），10﹪ ～ 50﹪為（+），50﹪ ～ 75﹪為（+ +），＞ 75﹪為（+ + +）。

四、統計分析

應用SPSS 13.0軟件包進行統計分析。計數資料分析組間相關采用秩和分析，同時進行Kaplan Meier 生存分析。以P ＜ 0.05為差異具有統計學意義

結 果

一、通過采用免疫組織化學方法檢測發現與正常乳腺組織相比，在乳腺癌組織中 14-3-3σ、Akt 蛋白過表達，且定位于細胞漿（圖1，2）；p27Kip1蛋白為細胞核和（或）細胞漿表達(圖3，4）。

二、采用 Wilcoxon 秩和檢驗或 Kruskal-Wallis 檢驗(表1)，分析發現胞漿 14-3-3σ、Akt蛋白或 p27Kip1蛋白胞漿表達均與淋巴結轉移和臨床分期呈正相關；應用 Kaplan Meier 法進行單因素生存分析并所繪制5年生存曲線結果表明（圖5，6）胞漿 14-3-3σ、Akt 蛋白過表達的病人生存期相對較短，p27Kip1蛋白胞漿錯誤定位的患者預后不良。

圖1 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中表達（×200）

圖2 Akt 蛋白在乳腺癌中表達（×200）

圖3 p27Kip1蛋白在乳腺癌細胞漿中表達（×200）

圖4 p27Kip1蛋白在乳腺癌細胞核中表達（×400）

表1 14-3-3σ、Akt 和 p27Kip1蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征相關性分析（例）

圖5 14-3-3σ 蛋白表達水平與生存時間( Kaplan-Meier 生存曲線)

圖6 Akt 蛋白表達水平與生存時間( Kaplan-Meier 生存曲線)

三、通過比較 14-3-3σ、Akt、p27Kip1蛋白與 Her-2的相關性發現，與 Her-2 陰性組比較，Her-2 陽性組的14-3-3σ、Akt 蛋白表達升高；而胞核 p27Kip1蛋白表達降低，胞漿表達水平升高；

四、Akt 與 ER 呈正相關，胞漿 p27Kip1蛋白表達與 PR 呈正相關，提示 PI3K/Akt 通路可能參與雌激素類蛋白表達，但具體機制仍有待進一步研究。同時，胞漿 Akt 和胞漿 p27Kip1表達水平與 VEGF 呈正相關，提示在 VEGF 促進血管內皮細胞增殖和抗凋亡的功能中，Akt蛋白和 p27Kip1蛋白可能發揮一定的作用。

討 論

一、14-3-3σ 蛋白，又稱人乳腺癌上皮標志物-1(human mammary epithelial marker 1, HEM1)[5]，是目前研究的所有14-3-3蛋白各亞型中與腫瘤關系最為密切的亞型[6]。Mong-Hong Lee等[7]在乳腺癌細胞株的研究發現 14-3-3σ 可以與 p53 結合穩定其表達，抑制其降解過程，提高其轉錄活性，使細胞周期阻滯在G2/M 期，從而抑制腫瘤增殖。

本研究是通過免疫組織化學方法檢測 14-3-3σ 在乳腺癌組織中和正常乳腺組織中的表達情況，結果為14-3-3σ 蛋白在乳腺癌組織中表達是過量的。這一結果與多數研究中所報道的 14-3-3σ 蛋白在多種腫瘤中表達下降并不一致，其中有報道認為 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌的表達增加[8]，而 Moreira 等[9]曾報道 14-3-3σ在乳腺癌表達下調只是偶發事件(表達缺失率3/68)。但多數報道支持由于 14-3-3σ 啟動了 CpG 島甲基化而導致在乳腺癌中該基因沉默[10]。但在此研究中14-3-3σ蛋白在Her-2陽性組織中表達增強,是否提示著14-3-3σ蛋白在Akt蛋白增加而p27Kip1蛋白降低情況下出現代償性增高作用，14-3-3σ 蛋白的表達與腫瘤淋巴轉移，TMN 分期有關，且隨臨床分期的增高，14-3-3σ 蛋白表達明顯增高。這些均提示 14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中的表達增多可能是一個預后不佳的潛在因素。生存曲線顯示隨 14-3-3σ 蛋白表達增強，生存率出現下降趨勢。

二、Akt蛋白，又稱為蛋白激酶B ( protein kinase B, PKB )，是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K )下游的直接靶蛋白，Akt 的活化依賴于 PI3K 對含有肌醇的膜磷脂酰肌醇環上3位羥基的特異磷酸化[11]。Akt 可通過多種途徑或作用多種因子促進調亡。例如，Akt 可以作用于下游的凋亡蛋白 Bad，使其磷酸化，抑制其促凋亡作用[12]；Akt 磷酸化 Forkhead 蛋白家族，促進 Forkhead 蛋白離開細胞核，從而抑制促凋亡基因轉錄[13]；Akt 可催化 MDM2 的 Ser166 和 Ser188 磷酸化，而磷酸化的 MDM2更有效地轉到核內，促使p53降解[14]，從而抑制凋亡。此外，Akt 參與多種途徑調節細胞周期的進程，如 Akt 可磷酸化細胞周期抑制物P27Kip1使其失活，阻止 P27Kip1進入細胞核從而抑制P27Kip1介導的 G1 期阻滯，促進增殖[15]。

本研究顯示乳腺癌中 Akt 蛋白在乳腺癌組織中高表達。此外，本研究對臨床病理資料進行分析，Akt 與淋巴結轉移和臨床分期顯著相關。這說明 Akt 可能與乳腺癌的發生發展有關，可用于臨床乳腺癌病情和治療的判斷。對于生存分析，生存曲線顯示了Akt 過表達的患者5年的生存率低于其表達陰性的患者。

三、p27Kip1蛋白，腫瘤的發生發展與細胞周期調控異常關系密切。細胞周期由正調控因子細胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)和負調控因子CDK抑制因子(CDK inhibitor, CKI)共同作用而精切調控。p27Kip1為 CKI 兩大家族之一的成員，p27Kip1定位于染色體12p13，主要通過對細胞周期從G1 期到S期的轉換抑制來抑制細胞增殖，其主要通過抑制多種 Cyclin-CDKs復合物(如cyclinE/CDK2, cyclinD1/CDK4復合物)的活性來實現其對細胞周期的調控，它可抑制多種 Cyclin-CDKs 復合物的活性，對細胞周期進行負調控，抑制細胞分裂和增殖，促進細胞分化和凋亡[16]。

p27Kip1蛋白發揮活性的區域在細胞核，當 p27Kip1蛋白自身被磷酸化后，磷酸化的 p27Kip1從細胞核轉入細胞漿，在細胞漿內通過泛素化-蛋白水解途徑水解失活[17]。本研究檢測 p27Kip1蛋白在乳腺癌組織的胞核表達率低于正常乳腺組織核表達。同時在胞漿表達豐富，高于正常乳腺組織胞漿表達。由此說明，p27Kip1可在胞漿和胞核表達，但對于腫瘤組織，由于磷酸化的 p27Kip1從胞核泄漏入胞漿，使得胞漿表達增加。實驗表明，p27Kip1蛋白與淋巴結轉移和臨床分期有密切關系，與腫瘤大小無關。p27Kip1蛋白胞核表達降低及胞漿表達增加，可提示 p27Kip1蛋白從核泄入漿的量增多，造成 p27Kip1泛素化失活，從而失去抑制腫瘤的功能。p27Kip1蛋白的核漿定位顛倒可用于提示乳腺癌的發展程度。生存曲線顯示了錯誤的核漿定位可能將不利于乳腺癌的預后。

四、乳腺癌的發生發展是一個多階段和多步驟的復雜過程，其中涉及眾多癌基因和抑癌基因失衡、信號通路傳導異常和細胞周期調節的改變等。PI3k-Akt 和 p27Kip1通路參與乳腺癌的發生發展，并在細胞膜Her-2 蛋白參與下發揮作用（圖7）。實驗表明，在 Her-2 陰性(缺失狀態)的乳腺癌組織中 Akt 蛋白的表達水平低于其在 Her-2 陽性組織中，提示 Her-2 存在情況下，Akt 蛋白表達增加，促進腫瘤細胞的增殖。同時 p27Kip1蛋白的胞核表達在 Her-2 陽性乳腺癌組織中也降低，而胞漿組織 p27Kip1蛋白表達水平升高，促進 p27Kip1蛋白從胞核到胞漿的釋放和降解，失去抑制腫瘤的作用。以上提示，Her-2 蛋白存在或者缺失可能對 PI3k-Akt 和 p27Kip1通路有直接影響。14-3-3σ 蛋白在 Her-2 陽性組織中表達增強，其水平高于在 Her-2 陰性的乳腺癌組織中。根據以往的研究，14-3-3σ 作為一種抑癌基因可直接抑制Akt的表達，從而增強 p27Kip1蛋白的細胞周期負調控作用；也可以增加 p27Kip1蛋白的穩定性，阻止 p27Kip1蛋白出核發生降解[18]。但在此研究中 14-3-3σ 蛋白在 Her-2 陽性組織中表達增強，是否提示著 14-3-3σ 蛋白在Akt蛋白增加而 p27Kip1蛋白降低情況下出現代償性增高作用、還是一種異常的反應、或者存在另外的蛋白分子影響其表達?這些需進一步探討。

圖7 Her-2 與 PI3K-Akt 通路在乳腺癌發病機制中作用

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Expression of three tumor markers in breast cancer tissue and its association with pathological characteristics

WANG Jin, ZHENG Qin, YANG Hui-ling. Department of Pathophysiology, Medical School, Sun Yat-sen University, GuangZhou 510080, China

YANG Hui-ling, E-mail: yanghl@mail.sysu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of 14-3-3σ, Akt and p27Kip1proteins in breast cancer, and evaluate their relations with clinicopathologic status and Her-2 protein.MethodsExpressions of 14-3-3σ, Akt and p27Kip1proteins were examined by immunohistochemistry (SABC) method and the retrospective analysis was conducted based on clinical data and follow-up.ResultsHigh-level expression of 14-3-3σ.Akt or p27Kip1protein in cytoplasm positively correlated with lymph nodal metastasis and TNM stage (P ＜ 0.01 or P ＜ 0.05), and probably predicted a poor prognosis; Her-2 protein may contribute to tumorigenesis and development of breast cancer mediated by PI3k-Akt and p27Kip1pathway.Conclusion14-3-3σ、Akt and p27Kip1proteins may serve as useful markers to predict lymph nodemetastasis and to evaluate prognosis of patients with breast cancer.

Breast cancer；Tumor marker；14-3-3σ protein；Akt protein；p27Kip1protein

2011-03-07)

(本文編輯:蔡曉珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2011.01.011

510080 廣州，中山大學病理生理學教研室

楊惠玲，E-mail：yanghl@mail.sysu.edu.cn

王瑾,鄭芹,楊惠玲.乳腺癌細胞腫瘤標記物表達及其與臨床病理特征相關性研究[J/CD]. 中華細胞與干細胞雜志: 電子版, 2011, 1(1): 74-80.