β-環糊精及其衍生物、金屬離子協同增敏黃曲霉毒素B1的熒光光譜分析及應用研究

摘 要 采用熒光光度法研究了β環糊精及其衍生物（βCDs）金屬離子（M）體系對黃曲霉毒素B1（AFB1）的熒光增敏作用。在βCDHg體系中，AFB1的熒光強度顯著增強。當溶劑中甲醇比例為50%，Hg2＋、βCD與AFB1反應摩爾比均大于300∶1時，熒光增強倍數最大，可達到15倍。將βCDHg作為新型熒光增強劑，替代國標方法中傳統衍生試劑，建立了高靈敏度、快速測定AFB1的熒光分析法。AFB1濃度在0.1～40

SymbolmA@ g/L范圍內與體系熒光強度呈線性關系，相關系數R為0.9998，檢出限為0.08

SymbolmA@ g/L，回收率為90%～100%；與國標方法及速測方法比對分析，檢測結果均無顯著性差異。

關鍵詞 β環糊精；黃曲霉毒素B1；熒光增強；三元絡合物

1 引 言

黃曲霉毒素B1（AFB1）于 1993年被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物，對人類健康危害極大。我國相關的限量標準已經過多次修訂（20

SymbolmA@ g/kg），但是相對于國際上所制定的限量標準（WHO/FAO規定為15

SymbolmA@ g/kg，EU規定為2

SymbolmA@ g/kg[1]），仍然明顯偏高[2]，因此亟需研究AFB1衍生試劑，以提高檢測靈敏度。目前，常用的強氧化劑有三氟乙酸和鹵族元素及衍生物等，但存在需加熱、穩定性差、試劑有腐蝕性，保存壽命短等不足，研究安全而穩定的新型熒光增強劑，提高光學系統靈敏度，成為研究黃曲霉毒素檢測技術的重要發展方向。

βCD是超分子化學最重要的主體[3]，利用βCD及其衍生物和多類客體分子形成超分子體系過程熒光強度發生變化的特性，將其作為熒光增敏試劑的研究和應用越來越多[4～9]，但在食品安全高靈敏度檢測技術的開發領域，缺乏利用βCDs三元絡合反應進行熒光增強作用的探索與研究[10]。本實驗對βCDsMAFB1三元體系進行了研究，通過超分子包絡作用研究AFB1熒光增強效應。實驗表明，βCDsM可作為AFB1的新型高效熒光增強劑。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F2500熒光分光光度儀（日本日立公司）； UV2450紫外分光光度計（日本島津公司）；NYARTI型AFB1定量熒光速測儀（華夏科創有限公司）。

AFB1（1 g/L甲醇溶液，美國Sigma公司）;甲醇（色譜純，天津四友公司）；β環糊精（βCD）、2，4二甲基β環糊精（DMβCD）、羥丙基β環糊精（HPβCD）、羥乙基β環糊精（HEβCD）、甲基β環糊精（MβCD）、葡萄糖基β環糊精（分析純，山東新大精細化工有限公司）；HgCl2（分析純，貴州銅仁汞試劑公司）；NaCl， FeCl3， MgCl2和CaCl2（分析純，成都市科龍化工有限公司）。

2.2 實驗方法

取1 mL混合均勻的AFB1樣液（溶劑中甲醇比例均為50%）于1.0 cm石英比色杯，進行熒光激發與發射光譜的掃描，儀器狹縫均為5 nm。 

取特定濃度AFB1標準品溶液，加入適量HgCl2和βCDs溶液（為調整甲醇/水比例，加入適量甲醇和水），混合均勻，用1.0 cm石英比色杯測量最佳激發與發射波長處熒光強度，狹縫均為5 nm。

移取適量AFB1標準液于試管中，依次加入1000倍體積的甲醇，200

SymbolmA@ L 0.01 mol/L HgCl，800

SymbolmA@ L 0.01 mol/L βCD（即最終溶劑中甲醇比例為50%），充分振蕩，同時做試劑空白，繪制工作曲線。

提取與凈化：參照GB/T 189792003[12]。在凈化后的甲醇洗脫液中加入200

SymbolmA@ L HgCl2，混勻后加入800

SymbolmA@ L 0.01 mol/L βCD溶液，混勻，于熒光光度計中讀取熒光值，帶入標準曲線計算其濃度。

2.3 AFB1IAC速測方法

準確稱取5.00 g樣品，加入15 mL 70%甲醇（含4% NaCl）；50 ℃水浴超聲提取3 min，漩渦振蕩；抽濾，收集濾液4 mL，加入2 mL石油醚，振蕩混勻后萃取；取下層溶液3 mL，加入8 mL純水，混合液過0.45

SymbolmA@ m雙層濾膜；濾液全部上免疫親和微柱純化（1.5 mL/min），以7 mL水洗滌，1 mL甲醇洗脫，收集洗脫液；加入1 mL純水混勻，移入比色皿，在速測儀中測定熒光本底值；加入200

SymbolmA@ L熒光增強劑，混勻，于速測儀中測定AFB1含量。

3 結果與討論

3.1 金屬離子對AFB1熒光的影響



按照2.2節的方法，對400

SymbolmA@ g/L AFB1進行光譜掃描，確定AFB1熒光增強體系的最大激發波長為365 nm，最大發射波長為432 nm。

某些金屬離子，尤其是Hg2＋，能夠與AFB1形成金屬螯合物，可大幅提高AFB1熒光強度。本實驗結合前期工作，進一步考察了不同金屬離子（濃度相同）對三元絡合反應的影響。Fe3＋有猝滅作用，Hg2＋對AFB1體系熒光增強效果明顯優于其它金屬離子。這可能是由于Hg屬于過渡金屬元素，易形成配位數為6的配合物，其幾何構型通常是相當于6個配位原子占據八面體或變形八面體的角頂，增強了配合物AFB1Hg2＋共軛平面，加大了剛性結構[3]。實驗表明，此配合物與βCD形成了三元超分子包絡物，熒光強度大大增加。

3.2 βCDs種類對βCDHgAFB1體系熒光的影響

不同βCDs衍生物對AFB1均有熒光增強作用，葡萄糖基βCD熒光增強幅度相對較小。其原因可能是其余4種衍生物均屬于環糊精醚衍生物，僅葡萄糖基βCD屬于單支鏈環糊精，取代基分子較大，對客體分子進入空腔造成了一定程度的阻礙。除葡萄糖基βCD外，βCD對其余4種衍生物的熒光增強值無顯著性差異（p＞0.05），且βCD成本較其衍生物更為低廉，約為其它βCDs價格的1/10，更適宜作為新型熒光增強劑。

3.3 AFB1HgβCD體系的光譜特性

對各體系熒光光譜特性進行比較（圖1），βCDHg2＋甲醇/水溶液在365/432 nm處無熒光產生。AFB1HgCl2βCD， AFB1βCD， AFB1Hg2＋反應體系的

[TS（][HT5”SS] 圖1 體系的激發和發射光譜

Fig．1 Excitation and emission spectra of systems（20

SymbolmA@ g/L aflatoxin B（AFB1））

1. HgCD; 2. AFB; 3. AFB1Hg; 4. AFB1CD; 5. AFB1HgCD.[HT][TS）]

最大激發波長基本未移動，說明基態分子結構均沒有發生變化。AFB1HgCl2βCD， AFB1Hg2＋的最大發射波長發生了相同的變化（432 nm到440 nm），說明AFB1與 Hg2＋很可能發生了配位反應，形成的AFB1Hg2＋螯合物作為客體分子被包合在βCD空腔內。同時，三元絡合物的增強程度很大，沒有其它峰干擾，可以有效提高檢測的靈敏度和選擇性。分析反應前后體系熒光強度增加的可能原因為：βCD空腔為AFB1的生色團提供了一個非極性環境，使其處于去水化狀態，對增進量子效應從而增強熒光強度提供了有利的條件；當AFB1包合進βCD分子的空腔后，βCD腔的構造保護了AFB1的熒光單級態分子免于外部猝滅；由于增加了疏水性AFB1在水中的溶解度，使得熒光強度增加。

將各體系紫外吸收光譜進行比較（圖2），在AFB1中加入Hg2＋后，最大吸收波長發生了明顯的藍移（364 nm到374 nm），表明AFB1和Hg2＋之間存在著某種相互作用，該作用可能與AFB1和Hg2＋形成金屬螯合物有關。在AFB1Hg2＋中加入CD后，最大吸收波長未發生變化（仍為374 nm），但吸光度增加。可以推測，AFB1Hg2＋螯合物作為客體分子進入βCD空腔內，形成了穩定的復合體，AFB1的共軛程度增加，從而增強了熒光強度。

3.4 熒光增強效應的影響因素

3.4.1 溶劑中甲醇比例 AFB1易溶于有機溶劑，在水中溶解度極低，在水相中易發生熒光猝滅作用；而βCD溶于水，并能夠增加AFB1在水相中的溶解度。在分析過程中，選擇適當的甲醇/水比例，能夠更好地達到增強熒光的效果。當甲醇/水的體積比為1∶1和5∶3時，反應時間短，反應穩定，熒光增強值高，且無顯著性差異（p＞0.05），考慮到檢測成本，選擇甲醇/水（1∶1， V/V）。對反應時間進行了考察，混勻后即可測定，48 h內保持穩定，表明形成的三元絡合物穩定。

3.4.2 反應摩爾比 當HgCl2， βCD與AFB1摩爾比均大于300:1時，反應完全， 且濃度升高對反應沒有影響。AFB1污染具有不均勻性，有高濃度含量樣品檢測，因此要確保Hg2＋過量，使測定準確快速穩定。通過計算最終確定加入200

SymbolmA@ L 0.01 mol/L HgCl2溶液。包合反應是可逆反應，體系中反應物濃度高有利于化學反應，因此確定0.01 mol/L βCD加入量為800

SymbolmA@ L。

3.4.3 衍生方法 采用兩種衍生方法：①先加入HgCl2，混勻后再加入βCD；②先加入βCD，混勻后再加入HgCl2。分別測定體系的熒光強度，結果表明，按照方法①進行衍生能夠達到更好的熒光增強效果。推測原因為AFB1與Hg2＋先形成配位體，再被βCD包合于空腔內形成三元絡合物。若按照方法②進行衍生，βCD空腔的構造保護了AFB1的熒光單級態分子免于從外部猝滅，從而不能與HgCl2完全螯合，未螯合的AFB1僅能形成AFB1βCD二元包合物或形成部分AFB1βCDHg三元包合物，因此不能

[FQ（8。２２，Ｙ－ＷＺ][HT5”SS][HJ*4]表1 不同熒光增強劑對AFB1熒光增強比較

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Studies and Application of Fluorescence of Aflatoxin B1 Enhanced by

Synergetic Effect of βCyclodextin and its Derivatives and Metalions



ZHANG Min1， ZHANG Yuhao1，2， MA Liang*1，2

1（College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400716）

2（Food Engineering andTechnology Research Center of Chongqing， Chongqing 400716）



Abstract Fluorescence enhancement of AFB1 by system of βCDM was studied by fluorescence spectrophotometry. In system of βCDHg， fluorescence intensity of AFB1 was markedly enhanced. When ratio of methanol in solvent was 50%， reaction molar ratio of βCD and HgCl2 with AFB1 were both more than 300∶1， the fluorescence enhancement could achieve the maximum16 times， significantly higher than various derivation reported and in National standard. βCDHg was used as new fluorescence enhancement agent to replace traditional derivation， in order to improve the detection sensitivity. And a high sensitivity and rapid determination of AFB1 was established. The fluorescence intensity was linearly related to the AFB1 concentration in the range of 0.1－40

SymbolmA@ g/L with a correlation coefficient of 0.9998. The detection limit was 0.08

SymbolmA@ g/kg. The recovery was between 90－100% by spiking 10

SymbolmA@ g/kg of AFB1 in samples. There are no significant differences between the new method and national standard method， as well as fast method.

Keywords βCyclodextrin; Aflatoxin B1; Fluorescent enhancement; Ternary complexes

（Recdived 1 April 2011; accepted 27 June 2011）