石墨烯/納米金復合材料的無酶葡萄糖生物傳感器制備

摘 要 [HTSS]以抗壞血酸（AA）為還原劑，通過同步還原法制得石墨烯/納米金復合材料。采用電化學方法，構建了一種基于石墨烯/納米金復合材料修飾電極的無酶葡萄糖生物傳感器。實驗中，通過伏安法考察了不同修飾電極在葡萄糖溶液中的電化學行為。同時，探討了溶液中OH－離子強度、溶解氧、掃描初始電位及石墨烯與納米金的比例對傳感器響應特性的影響。在優化實驗條件下，采用線性掃描伏安法檢測葡萄糖的線性范圍為0.1～20 mmol/L，檢出限為1.6×10－5 mol/L（S/N ＝3）。對1 mmol/L葡萄糖平行測定10次，其相對標準偏差為2.7%。實驗結果表明，此傳感器具有較高的靈敏度、較好的重現性、穩定性及抗干擾能力。本方法可用于人血清樣品中葡萄糖含量的測定，回收率為96.2%～103.2%，結果令人滿意。

關鍵詞 [HTSS]石墨烯； 納米金（GNPs）； 葡萄糖； 無酶傳感器； 電化學

1 引 言

葡萄糖的分析與檢測對人體的健康及疾病的診斷、治療和控制有著重要意義，因此，葡萄糖傳感器的研究始終是化學與生物傳感器研究的熱點之一。在諸多類型的葡萄糖傳感器中，有關葡萄糖電化學傳感器的研究較多[1，2]。常見的葡萄糖電化學傳感器主要分為有酶和無酶兩種類型。有酶傳感器是基于酶對底物的特異性識別功能，具有專一性及高度選擇性。然而，由于酶的活性易受到周圍環境如溫度、濕度及化學環境等因素的影響[3]，且固載的酶可能會泄漏，以致影響傳感器的穩定性及使用壽命，在一定程度上限制了該類傳感器的應用范圍。無酶葡萄糖傳感器是一種基于葡萄糖分子在相關催化活性材料表面的電催化氧化信號對其進行定性及定量檢測的傳感裝置。近年來，一些具有催化性能的納米材料已被廣泛用于制備新型的無酶葡萄糖傳感器，此類傳感器因制備簡單、穩定性好，可重復利用，價格低廉，能在無酶情況下直接檢測葡萄糖，目前已成為葡萄糖電化學傳感器研究領域的熱點[4]。Kumiawan等[5]研究了金納米顆粒修飾的金電極與未修飾的金電極分別在堿性溶液中對葡萄糖的響應情況，結果表明：在相同條件下， 金納米顆粒修飾的電極對葡萄糖的催化氧化電流高于未修飾的金電極。俞建國等[6]采用電刻蝕法制得微鎳電極，利用堿性條件下葡萄糖在該修飾電極表面的電催化氧化性質，制備了新型抗干擾無酶葡萄糖微傳感器。目前，基于金屬納米材料與碳納米管等碳基材料復合物的無酶葡萄糖傳感器研究多有報道[7～10]。石墨烯作為一種具有二維結構的新型碳基材料，因其具有更大的比表面積及高電子傳導能力、原料易得且價格便宜等優點，已成為繼碳納米管后新一代的理想電極修飾材料[11，12]。將其代替碳納米管等材料應用到無酶葡萄糖傳感器的制備尚未見報道。

本研究結合金納米顆粒與石墨烯的優點，通過同步還原法制得石墨烯/納米金復合材料，再采用滴涂法并利用Nafion的穩定作用將該復合材料修飾在玻碳電極表面，研制出一種高性能的無酶葡萄糖生物傳感器。該傳感器可用于對臨床樣品的檢驗，具有靈敏度高， 選擇性和穩定性好等特點。2 實驗部分

2.1儀器與試劑

CHI660D電化學工作站（上海辰華儀器公司）；電化學測量采用三電極系統：玻碳電極（Φ＝3 mm）或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑絲電極為對電極；KQ100E型超聲清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；BSZ24S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；GL16Ⅱ型離心機（上海安亭科學儀器廠）；5500型原子力顯微鏡（AFM，美國安捷倫科技有限公司）。葡萄糖（上海生物工程有限公司）；Nafion（5%，Sigmaaldrich公司）；納米級石墨粉（40 nm），抗壞血酸（AA），尿酸（UA），氯金酸（阿拉丁試劑公司）；實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次去離子水。

2.2 石墨烯的合成

氧化石墨烯（GO）的制備在Hummers法[13]的基礎上進行了改進。即稱取1 g納米級石墨粉和0.5 g NaNO3于250 mL燒杯中，在冰浴中混合并攪拌，緩慢加入23 mL H2SO4，控制溶液溫度在20 ℃以下。在劇烈攪拌下加入3 g KMnO4，在冰浴中控制溶液溫度低于20 ℃；隨后移去冰浴升溫到（35±3） ℃，保持反應30 min（在20 min后，液體變粘稠且有少量氣體揮發）；然后將46 mL H2O緩慢加入到粘稠組分中，攪拌（有大量氣泡產生，溫度會升到98 ℃）；保持溫度反應15 min，隨后用溫水稀釋至140 mL，用3% H2O2還原過量的KMnO4，還原后溶液呈亮黃色。

以8000 r/min離心10 min，移去上層清液，重復3次；以4000 r/min離心5 min，取上層亮黃色氧化石墨烯溶液；最后將氧化石墨烯還原，即得石墨烯產品，產率約為10%。

 

2.3 石墨烯/納米金復合材料的制備

采用同步還原法制備石墨烯/納米金復合材料。首先將80

SymbolmA@ L 5 mmol/L HAuCl4#8226;3H2O溶液與20

SymbolmA@ L 1.0 g/L GO溶液混合；隨后加入800

SymbolmA@ L H2O稀釋， 并使之混合均勻，在超聲振蕩條件下加入100

SymbolmA@ L 0.1 mol/L 抗壞血酸溶液，維持該條件反應20 min，所得混合物于室溫下靜置48 h。在復合材料的制備過程中，石墨烯表面含氧官能團的數量對其與金納米顆粒間的連接起至關重要作用[14]。未加入抗壞血酸前，GO表面大量的含氧官能團為Au3＋在其表面的有效吸附提供了保證；加入抗壞血酸后，GO表面的Au3＋首先被還原成微小的金核，隨后逐漸形成金納米顆粒，而GO表面未吸附有Au3＋的含氧官能團則直接被抗壞血酸還原，最終得到穩定的石墨烯/納米金復合材料。該復合材料的原子力顯微鏡圖像（圖1）表明，所得的石墨烯材料的厚度約為1 nm，其上面負載納米金顆粒的粒徑約為5 nm。

[TS（][HT5”SS]圖1 石墨烯/納米金復合材料的AFM形貌圖

Fig．1 AFM topography of grapheme（Gr）/gold nanoparticle （GNPs） nanocompsites [TS）]

2.4 修飾電極的制備

將玻碳電極用Al2O3 粉在拋光布上拋光，然后依次用蒸餾水，無水乙醇和二次蒸餾水超聲清洗1 min。洗凈的電極再用二次蒸餾水沖洗，最后用N2吹干，備用。

實驗前將電極修飾材料（石墨烯、石墨烯/納米金復合物）預先超聲分散30 min，移取5

SymbolmA@ L懸浮液滴涂于已拋光好的玻碳電極表面，置于紅外燈下干燥2 h，然后在修飾過的電極表面滴5

SymbolmA@ L 1% Nafion乙醇溶液，置于室溫下晾干，即制得相應材料修飾的玻碳電極。用伏安法測定前，修飾電極需置于K3Fe（CN）6 溶液中循環掃描（電位掃描范圍－0.6～0.6 V， 掃描速率100 mV/s），直到獲得重復性響應且氧化還原峰電位差在80 mV以內。 

2.5 實驗方法

實驗采用三電極體系，以NaOH溶液作為支持電解質，加入適量葡萄糖溶液，分別采用循環伏安法和線性掃描法進行測試。電位掃描范圍為－0.6～0.6 V （vs. SCE），掃描速率為100 mV/s；電化學測量均在室溫條件下進行。除特別說明，所有測試底液均通高純氮氣20 min除氧，并在整個實驗過程中保持氮氣氣氛。

3 結果與討論

3.1 葡萄糖在不同修飾電極上的電化學行為

將制得的石墨烯/納米金修飾電極、石墨烯修飾電極及裸玻碳電極分別置于含0.01 mol/L葡萄糖的NaOH溶液進行循環伏安掃描，實驗前未通N2除氧，結果如圖2所示。

[TS（][HT5”SS] 圖2 葡萄糖在石墨烯/納米金修飾電極（a）、石墨烯修飾電極（b）以及裸玻碳電極（c）上的循環伏安曲線

Fig．2 CVs of glucose at Gr/GNP/GCE（a）， Gr/GCE（b） and bare GCE（c） in 0.20 mol/L NaOH solution[TS）]

由圖2可知，葡萄糖在裸玻碳電極及石墨烯修飾電極上均無明顯電化學響應，而在石墨烯/納米金修飾電極上則可觀察到明顯的氧化還原信號。表明納米金顆粒在無酶葡萄糖傳感器的構建中具有產生電化學氧化還原信號的重要作用。相對于裸玻碳電極，葡萄糖在石墨烯修飾電極上具有更高的背景電流，表明石墨烯的高電子傳導能力可有效地增強修飾電極的信號強度，進而提高傳感器的靈敏度。在石墨烯/納米金修飾電極上，當掃描電位由－0.60 V向0.60 V變化時，分別在－0.30， 0.08和0.35 V處觀察到3個氧化峰，其中－0.30 V處的氧化峰歸因于葡萄糖的直接電化學氧化，0.08 V的氧化峰對應著葡萄糖氧化產物“葡萄糖酸內酯”的進一步氧化[15，16]，表明石墨烯/納米金修飾電極對葡萄糖的電化學氧化具有良好的電催化活性，0.35 V處的氧化峰對應著在堿性條件下金氧化物的形成[5]。在電位由0.60 V向－0.60 V反向掃描的過程中，在－0.04 V處可觀察到一個明顯的氧化峰同時該峰在－0.3 V附近還伴有一個肩峰。位于－0.04 V處的氧化峰是由反向掃描過程中金氧化物被還原后，葡萄糖的二次氧化產生的[17]。考慮到實驗之前未進行通N2除氧步驟，位于－0.3 V處的肩峰是由于溶液中溶解氧的還原產生的[18]。介于－0.04 V處的氧化峰具有良好的峰形和顯著的峰電流，在隨后的實驗中將以該氧化峰的電流強度與葡萄糖的濃度做工作曲線對葡萄糖進行定量分析。

3.2 檢測條件對傳感器響應特性的影響

3.2.1 OH－離子強度的影響 葡萄糖氧化電流的強度不僅與其自身的濃度有關，OH－濃度也是重要的影響因素。OH－的存在能夠使葡萄糖分子更容易吸附于電極表

面的石墨烯/納米金上，并降低了葡萄糖氧化的活化能[16]。 本實驗將10

SymbolmA@ L 1 mol/L葡萄糖標準溶液分別加入10 mL濃度為0.02， 0.05， 0.10， 0.20和0.30 mol/L的NaOH底液中，用循環伏安法考察了OH－濃度對葡萄糖氧化峰電流的影響（圖3）。

由圖3可知，隨著NaOH濃度，即溶液中OH－濃度的增加，葡萄糖的氧化峰電流逐漸增大，當OH－濃度高于0.20 mol/L時，峰電流隨底液濃度增加而降低。因此，本實驗以0.20 mol/L NaOH溶液作為葡萄糖電化學檢測的支持電解質。

3.2.2 溶解氧對傳感器的影響

實驗中所配制的溶液在存放過程中均會溶解一定量的氧氣，溶液中的溶解氧對測定有一定的影響。因此，本實驗采用通氮氣20 min除氧，然后在氮氣保護氣氛下進行測定，以消除溶解氧的干擾。實驗結果如圖4所示。

[TS（][HT5”SS]圖4 A. 修飾電極在NaOH支持電解質中未除氧（a）與除氧后（b）的循環伏安曲線；B. 修飾電極在含葡萄糖的NaOH溶液中未除氧（a）與除氧后（b）的循環伏安曲線

Fig．4 A. CVs of modified electrode in NaOH supporting electrolyte solution without exclusion O2（a） and with the exclusion of O2 （b）; B: CVs of modified electrode in the NaOH solution of glucose without exclusion O2（a） and with the exclusion of O2（b）[TS）]

由圖4可知，向樣品溶液中通氮氣20 min后，修飾電極在NaOH底液中的循環伏安曲線更加平整，在含葡萄糖的NaOH底液進行循環伏安掃描時，通氮氣前位于－0.3 V處的肩峰消失，此結果進一步表明了原－0.3 V處的肩峰與溶解氧的還原有關。

3.2.3 掃描初始電位對傳感器的影響 線性掃描伏安法是一種常見的定量分析手段，通過線性掃描的峰電流與標準樣品的濃度之間的關系即可確定傳感器的工作曲線。在線性掃描的過程中初始電位的正確選擇與否會直接影響到傳感器的檢測性能。本實驗在0.20 mol/L NaOH溶液中加入適量葡萄糖，使其最終濃度為0.01 mol/L，并通過線性掃描伏安法測定了不同初始電位對葡萄糖氧化峰電流的影響，實驗中掃描初始電位分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8V，掃描終止電位為－0.6 V，掃描速率100 mV/s，結果如圖5所示。

[TS（][HT5”SS] 圖5 A. 不同初始電位下0.01 mol/L葡萄糖在0.2 mol/L NaOH溶液中的反向線性掃描伏安（LSV）曲線； B. LSV的初始電位對葡萄糖氧化峰電流的影響

Fig．5 A. Linear scanning voltammetric (LSV) curves of 0.2 mol/L NaOH solution containing 0.01 mol/L glucose with different initial potentials in negative scans; B. Effect of initial potentials of LSV on peak current of glucose oxidation[TS）]

由圖5可知，隨著線性掃描初始電位的正移，響應電流呈先增大再減小的變化趨勢，在掃描初始電位為0.6 V處傳感器的響應電流達到最大值，即在該初始電位下該傳感器的靈敏度最高，因此，本實驗以0.6 V作為線性掃描初始電位。

3.2.4 石墨烯與納米金的比例對傳感器的影響

在石墨烯/納米金復合材料的制備過程中，固定5 mmol/L HAuCl4#8226;3H2O溶液與1.0 g/L GO溶液的總體積為100

SymbolmA@ L，改變兩者的體積比分別為1∶9， 2∶ 8， 3∶7， 4∶6， 5∶5， 6∶4， 7∶3， 8∶2， 9∶1， 制得不同石墨烯/納米金比例的復合材料，在上述優化條件下對0.01 mol/L 葡萄糖進行線性掃描伏安法測定，葡萄糖氧化峰電流與V(HAuCl4#8226;3H2O∶V(GO)的關系見圖6。

[TS（][HT5”SS] 圖6 HAuCl4#8226;3H2O， GO的比例與葡萄糖氧化峰電流的關系

Fig．6 Relationship between the ratio of HAuCl4#8226;3H2O and graphene oxide （GO） and the peak currents of glucose oxidation[TS）]

由圖6可知，隨著混合物中HAuCl4#8226;3H2O比例的增加，葡萄糖在修飾電極表面的氧化峰電流強度逐漸增加。當兩者體積比達到8∶2時， 峰電流達到最大值，之后呈微弱的下降趨勢。即在原料比為8∶2時得到的復合材料修飾電極可使傳感器獲得最大電流響應，故最終選用該復合材料修飾電極構建無酶葡萄糖生物傳感器。

3.3 線性檢測范圍及檢出限

在上述選定的最佳實驗條件下，用線性掃描伏安法測定葡萄糖的氧化峰電流與濃度之間的關系。傳感器的線性范圍為0.1～20 mmol/L； 線性回歸方程為Y（

SymbolmA@ A）＝2.4544＋0.6659X （mmol/L），相關系數為 0.9994；其檢出限為1.6×10－5 mol/L （S/N＝3），5次平行實驗的相對標準偏差（RSD）在2%～5%之間，表明方法重現性良好。本傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限，其性能可與無酶葡萄糖傳感器相媲美。由于正常人體內的葡萄糖含量在3.0～8.0 mmol/L范圍內[19]， 本傳感器可滿足人血清樣品中葡萄糖含量測定的要求。



3.4 傳感器的選擇性

在實際樣品測定時，一些葡萄糖共存物可能對測定會產生影響。本實驗對可能產生干擾的物質，如尿酸（UA），抗壞血酸（AA）等，進行了干擾測試。據文獻[21]報道，健康人血清中的UA與AA的含量分別是0.02和0.1 mmol/L，在含5 mmol/L葡萄糖的0.2 mol/L NaOH溶液中分別加入0.2 mmol/L UA和1.0 mmol/L AA后，葡萄糖氧化峰電流分別增加了1.3%和2.6%，表明UA和AA的加入對葡萄糖的測定幾乎不產生影響。這主要是由于修飾電極表面的Nafion膜具有排斥中性分子和陰離子的能力，從而可以選擇性地透過某些電活性物[22]。在堿性條件下，UA和AA均為陰離子，被Nafion陽離子交換膜擋在傳感器外，有效阻止了UA和AA向電極表面擴散，因而可有效消除這些電活性物質的干擾。

3.5 傳感器的重復性及穩定性

在優化實驗條件下使用同一支修飾電極對葡萄糖濃度為1 mmol/L的溶液重復測定10次，電流氧化峰電流平均值為3.47

SymbolmA@ A，其相對標準偏差為2.7%。實驗后將傳感器于4 ℃下懸于0.2 mol/L NaOH溶液中保存，每天檢測一次，10 d后電極的響應信號為初始的 87.4%。表明該傳感器具有較好的穩定性。這主要是由于石墨烯/納米金修飾電極表面所滴涂的Nafion膜可防止電極修飾材料在溶液中脫落，進而提高了傳感器的穩定性。

3.6 血清中葡萄糖的檢測

分別取1.0 mL血清樣品（商丘市中心醫院提供），用0.2 mol/L NaOH溶液稀釋至10.0 mL，按上述方法測定；同時，為了進一步考察此修飾電極的實用性，與常用市售血糖檢測儀進行了測試比較。結果見表1。連續測定5次，3份樣品的分析結果的RSD均小于3%，樣品加標回收率在96.2%～103.2%之間，本方法

13.81a， 4.3b， 4.9c0.50022.07a103.2a

27.42a， 8.0b， 7.6c0.5004.33a97.6a

317.26a， 18.2b， 17.6c0.50012.30a96.2a

[BHDFG３*2，WKZQ0W] a. 本方法，b. 羅氏卓越型血糖儀，c. 強生穩豪倍優型血糖儀（a. The present method; b: by Roch AccuChek performa blood glucose meter; c: by Johson OneTouch ultraVue blood gluscose meter）。 [BG）W][HJ]

檢測結果與常用市售血糖儀的偏差較小，具有良好的實用性。

References

1 Gooding J J， Praig V G， Hall E A H. Anal. Chem.， 1998， 70（11）: 2396～2402

2 WANG MeiFang， ZHANG Wei， FANG Bin（汪美芳， 張 偉， 方 賓）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 38（1）： 125～128

3 Wilson R， Tumer A P F. Biosens. Bioelectro.， 1992， 7（3）: 165～185

4 Park S， Boo H， Chung T D. Anal. Chim. Acta， 2006， 556（l）: 46～57

5 Kurniawan F， Tsakova V， Mirsky V M. Electroanalysis， 2006， 18（1920）: 1937～1942

6 YU JianGuo， LI JianPing（俞建國， 李建平）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2008， 36（9）: 1201～1206

7 Rong L Q， Yang C， Qian Q Y， Xia X H. Talanta， 2007， 72（2）: 819～824

8 Kang X H， Mai Z B， Zou X Y， Cai P X， Mo J Y. Anal. Biochem.， 2007， 363（1）: 143～150

9 Wu H X， Cao W M， Li Y， Liu G， Wen Y， Yang H F， Yang S P. Electrochim. Acta， 2010， 55（11）: 3734～3740

10 Zhu H， Lu X Q， Li M X， Shao Y H， Zhu Z W.Talanta， 2009， 79（5）: 1446～1453

11 Alwarappan S， Erdem A， Liu C， Li C Z. J. Phys. Chem. C， 2009， 113（20）: 8853～8857

12 Zhou M， Zhai Y M， Dong S J. Anal. Chem.， 2009， 81（14）: 5603～5613

13 Hummers W S， Offema R E. J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80（6）: 1339

14 Goncalves G， Marques P A A P， Granadeiro C M， Nogueira H I S， Singh M K， Grcio J. Chem. Mater.， 2009， 21（20）: 4796～4802

15 Larew L A， Johnson D C. J. Electroanal. Chem.， 1989， 262（12）: 167～182

16 Adzic R R， Hsiao M W， Yeager E B. J. Electroanal. Chem.， 1989， 260（2）: 475～485

17 Matsumoto F， Harada M， Koura N， Uesugi S. Electrochem. Commun.， 2003， 5（1）: 42～46

18 Chen X M， Lin Z J， Chen D J， Jia T T， Cai Z M， Wang X R， Chen X， Chen G N， Oyama M. Biosens. Bioelectro.， 2010， 25（7）: 1803～1808

19 Bai Y， SunY Y， Sun C Q. Biosens. Bioelectro.， 2008， 24（4）: 579～585



Investigation of Nonenzymatic Glucose Biosensor Based on

Graphene/Gold Nanocomposites



ZHU Xu1， LI ChunLan1， LIU Qin2， ZHU XiaoHua1， ZHANG YinTang1， XU MaoTian*1



1（Department of Chemistry， Shangqiu Normal University， Shangqiu 476000）

2（Department of Chemistry and Environment， South China Normal University， Guangzhou 510631）





Abstract Graphene/gold nanoparticles（GNPs） nanocomposites were synthesized by a simple chemical reduction method. A novel nonenzymatic biosensor for glucose based on graphene/GNPs modified glassy carbon electrode was prepared by electrochemical method. The electrochemical behavior of different modified electrodes was investigated by cyclic voltammetry （CV）. Meanwhile，the effects of solution ion intensity， dissolved oxygen and initial scan potential on the sensor response characteristics were studied. Under the optimal conditions， the resulting biosensor displayed a rapid response to glucose. It shows a linear range from 0.1×10－3 to 20×10－3 mol/L with a detection limit of 1.6×10－5 mol/L（S/N＝3）. The relative standard deviation was 2.7% for 1 mmol/L glucose （n＝10）. The biosensor shows high sensitivity， good reproducibility， stability and can avoid the interference of commonly coexisted substances. The established method was successfully applied for the determination of glucose in human serum samples with the recovery of standard addition between 96.2% and 103.2%.

Keywords Graphene; Gold nanoparticles; Nonenzymatic biosensor; Glucose; Electrochemistry

（Received 20 January 2011; accepted 20 July 2011）