代謝組學血漿樣品前處理及其快速高分辨液相色譜質譜分析方法研究

摘 要 采用快速高分辨液相色譜質譜聯用技術，對代謝組學研究中血漿樣品的前處理方法進行了考察及優化，建立了用于血漿中小分子代謝物分析的前處理方法。通過考察有機溶劑沉淀蛋白（不同溶劑系統）和固相萃取（Solid phase extraction， SPE）兩種方法對血漿中蛋白質去除程度及16個代表性化合物的提取效果，確定采用乙腈沉淀蛋白法；進一步對乙腈沉淀蛋白法進行了細致的優化，確定使用3倍體積的冷藏乙腈慢速沉淀可以達到最佳的處理效果。對血漿中10種代表性化合物進行了方法學考察，結果表明，本方法重現性、精密度及樣品凍融穩定性均良好。對穿插在檢測序列中的生物質控樣本檢測結果進行主成分分析（Principal component analysis， PCA），證明本方法在代謝組學研究中的可重復性及獲得的數據的可靠性良好，適用于代謝組學研究。

關鍵詞 代謝組學； 血漿前處理方法； 快速高分辨液相色譜質譜聯用技術

1 引 言



代謝組學是研究生物體內源性代謝物的整體及其變化規律的科學[1～4]，作為系統生物學的重要組成部分得到了迅速發展，并在制藥、藥物毒理等領域得到了成功應用[5～9]。人體血漿作為代謝組學研究中的重要體液樣本，其中含有2000多種內源性小分子代謝物[10]，與常見的尿液樣本相比，前處理過程相對復雜。首先，由于含有大量的蛋白質類成分，因此進行HPLCMS分析前需要去除蛋白質；其次，由于血漿中所含成分種類繁多、極性跨度很大，既有高極性的氨基酸、葡萄糖、核苷類等，也有低極性的脂類、固醇類等代謝物。代謝物成分的復雜性增加了血漿樣品分析的難度與挑戰[11]。本研究采用快速高分辨液相色譜質譜聯用技術（Rapid resolution liquid chromatographymass spectrometry， RRLCMS）技術，針對血漿樣品前處理中常用的有機溶劑沉淀蛋白法與固相萃取方法進行了比較，并進行了方法優化及方法學考察；采用主成分分析（Principal component analysis， PCA）對穿插在檢測序列中的質量控制（Quality control， QC）樣品數據進行統計分析，最終建立了適合于代謝組學研究的血漿樣品前處理方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200 Series RRLC system（德國Waldbronn Aglient Technologies 公司）；QTRAPTM四極桿線性離子阱串聯質譜儀（美國Applied Biosystems/MDS SCIEX公司），配有ESI源和Analyst QS 1.5數據處理系統； 乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和甲酸（色譜純， Merck公司）；標準品分別購自Fluka公司、SigmaAldrich公司及中國藥品生物制品檢定所；實驗用水為超純水。

人血漿樣品（EDTA抗凝），采自中國醫學科學院北京協和醫院，采集后立即于－80 ℃冷凍保存。

2.2 色譜條件

Zorbax AqC18 色譜柱 （100 mm×2.1 mm×1.8

SymbolmA@ m; 美國Agilent公司） ；流動相：A為H2O（含0.1% formic acid）; B為CH3CN。線性梯度洗脫：0～20 min，0～100% B；20～23 min，100% B。每次進樣前，色譜柱在初始流動相條件下平衡8 min，流速 250

SymbolmA@ L/min。柱溫 60 ℃；進樣量 5

SymbolmA@ L。

2.3 質譜條件

ESI離子源，分別采用正、負離子EMS掃描模式，噴霧電壓為5500～4500 V，解簇電壓（DP）為50～－50 V，源溫度375 ℃，霧化氣為7.5 MPa，干燥氣為 6.5 MPa，氣簾氣為4.0 MPa，掃描范圍為65～850 Da。數據采集和處理采用Analyst 1.5數據處理系統。

 分 析 化 學第39卷

第12期徐 婧等： 代謝組學血漿樣品前處理及其快速高分辨液相色譜質譜分析方法研究 

2.4 標準品及樣品的制備

（1）標準品溶液1 肌酐（Creatinine，Crea）、L半胱氨酸（LCysteine，Cys）、L異亮氨酸（LIsoleucine，Ile）、馬尿酸（Hippuric acid，HA）、葡萄糖（Glucose，Gl）、L酪氨酸（LTyrosine，Tyr）、犬尿烯酸（Kynurenic acid，KA）、枸櫞酸（Citric acid，CitA）、胞苷（Cytidine，Cyt）、次黃嘌呤（Inosine，Ino）、亞油酸（Linoleic acid，LA）、甲睪酮（Methyltestosterone，MT）、炔諾孕酮（Norgestrel，Nor）、氫化可的松（Hydrocortisone，HyC）、膽酸（Cholic acid，ChoA）、煙酸（Nicotinic acid，NA）。根據代謝物數據庫http://www.hmdb.ca獲得以上16種標準品在人體血漿中的正常濃度，按照各化合物在正常人體中血漿濃度的100倍制成1 mL的混合標準溶液作為儲備液，用于不同前處理方法比較。（2）標準品溶液2 肌酐，L異亮氨酸，L酪氨酸，犬尿烯酸，氫化可的松，亞油酸（linoleic acid，LA），膽酸，甲睪酮， 炔諾孕酮， 煙酸，以上10個標準品按照正常血漿濃度的100倍配成混合標準溶液，用于方法學考察。（3）QC樣品 血漿樣品4 ℃解凍，乙腈預先4 ℃冷藏24 h，在150

SymbolmA@ L血漿中加入3倍體積的乙腈，渦旋混合30 s， 4 ℃靜置10 min，以12000 r/min離心10 min，上清液轉移至EP管，在40 ℃水浴中以氮氣吹干，最后用80

SymbolmA@ L乙腈水（3∶1，V/V）超聲復溶。27例健康人血漿分別按以上方法處理后，各取10

SymbolmA@ L合并，配制成QC樣品。

2.5 數據處理

由RRLCESIMS檢測獲得的QC樣品最初數據經過Wiff to mzData translator software （version 1.0.0.4， Applied Biosystems/MDS Sciex） 轉換成XCMS可識別的mzData格式，閾值設置為 1%。采用XCMS進行保留時間校準、峰識別、濾噪、峰匹配，獲得可視化的原始二維數據陣。獲得的數據矩陣導入多變量統計軟件SIMCAP software 12.0 （Umetrics AB， Ume， Sweden）進行PCA分析。

3 結果與討論

3.1 血漿前處理方法的選擇

本研究對血漿處理中常用的有機溶劑沉淀法（包括4種不同的溶劑系統：甲醇、乙腈、甲醇乙醇（1∶1，V/V）；[TS（] 圖1 不同前處理方法獲得的標準品化合物提取離子色譜峰強度比較

Fig．1 Comparison of peak intensity in extracted ion chromatograms （XICs） about each standard compound with different preparation methods[TS）]甲醇乙腈丙酮（1∶1∶1，V/V）和固相萃取方法進行了系統分析。空白血漿中加入5

SymbolmA@ L混合標準品1，采用不同方法進行前處理，通過對各處理方法獲得的總離子流圖中色譜峰數量、峰強度及混合標準品1中各化合物峰面積的考察，獲得每種方法對各成分的提取效果，結果如圖1所示。從圖1可見，16個化合物經過沉淀蛋白處理后均可得到檢測，而經過SPE處理后有3個化合物（煙酸， 肌酐和半胱氨酸）未被檢測到。此外，對不同方法處理后的色譜峰強度進行比較發現，大部分化合物在經乙腈沉淀處理后獲得的強度最高，而SPE處理后化合物的提取效果較差，這是由于SPE處理時極性大的化合物在固相萃取柱上的保留效果較差， 以致流失；雖然蛋白與小分子的親和作用，使得在有機溶劑沉淀蛋白時一部分小分子化合物也會隨著蛋白一起沉淀而損失，但是與SPE中化合物的流失相比，大部分化合物，尤其是極性較大化合物的提取效果更好，因此，目前諸多研究中血漿前處理也采用乙腈沉淀法[10，12，13]。

對乙腈沉淀蛋白方法中沉淀溶劑的體積及溫度進行了優化。分別選擇血漿與乙腈的體積比為 2∶1， 3∶1， 4∶1， 5∶1的溶劑系統對沉淀體積進行比較，結果表明，3倍體積的乙腈對大部分化合物的提取效果最佳（圖2）。溶劑的溫度優化為冷溶劑（乙腈放入4 ℃冰箱冷藏24 h）與室溫溶劑的效果比較（圖3），結果顯示，冷藏保存的乙腈有更佳的提取效果。該結果與文獻[13，14]的結論一致， 確證了冷溶劑進行提取方法的有效性。

[TS（] 圖2 血漿與乙腈的體積比對提取效率的影響

Fig．2 Evaluation of extracting efficiency with different volume of acetonitrile[TS）]

[TS（] 圖3 不同溫度乙腈的提取效果比較

Fig．3 Evaluation of extracting efficiency with different temperature of acetonitrile[TS）]

3.2 方法學考察結果

3.2.1 精密度考察 儀器的精密度考察：將配制的標準品混合溶液2分別稀釋10、50和100倍（即配制為10倍體液濃度、2倍體液濃度、體液濃度的10種標準品混合溶液）。稀釋后的混合液2分別進行RRLCMS檢測分析，通過連續進樣6次，計算各色譜峰保留時間和提取離子色譜峰峰面積的RSD值。結果表明，在10倍體液濃度溶液中10個標準品化合物的RSD值均小于15%，8個化合物RSD值小于5%；尤其是在檢測信號強度較低（Peak area ≤107）時，RSD均小于5%；2倍體液濃度和體液濃度溶液中10個標準品化合物RSD指均小于15%；檢測信號強度較低（Peak area ≤107）時，RSD均小于10%。人體內的部分微量代謝物對維持機體正常的生理活動至關重要。本結果說明，在使用代謝組學方法找到的可能生物標志物中，即使提取離子峰強度較低的代謝物的可靠性也較高。

方法的精密度考察:分別取混合標準品2溶液6，3和1.5

SymbolmA@ L，加入150

SymbolmA@ L空白血漿中，采用3倍體積乙腈沉淀法進行樣品前處理，高中低3個濃度水平分別平行測定6次；采用RRLCMS進行檢測，并計算相應化合物的提取離子色譜峰面積RSD值。結果顯示，10個標準品化合物在3個濃度下的RSD值均小于20%，表明方法的精密度良好。

3.2.2 樣品的凍融循環穩定性 對同一份血漿樣品分別進行凍融1，2和3次處理（每組重復處理2次），考察凍融循環后樣品的穩定性。具體步驟如下：取6份相同血漿各150

SymbolmA@ L，分別標記為①～⑥，①②加入7.5

SymbolmA@ L 混合標準溶液后按前處理方法處理；③～⑥加入7.5

SymbolmA@ L混合標準溶液后20 ℃冷凍保存；樣品復融，③和④加入7.5

SymbolmA@ L混合標準溶液后按2.4（2）節步驟繼續處理；⑤和⑥融化后再一次20 ℃冷凍，4 ℃融化后按2.4（2）節步驟處理。經過不同冷凍循環處理后的樣品，測定標準品中所含化合物的提取離子峰峰面積，并計算RSD值，結果均小于15%。結果表明，樣品經不同凍融循環后，不會引起數據統計學上的差異，樣品凍融穩定性良好。

3.3 數據可靠性分析

采用本方法對大批量血漿樣本進行代謝組學分析，連續進行5次測定QC樣本，使系統達到平衡，每分析10個血漿樣本穿插1次QC樣本的檢測。圖4是分別在正、負離子檢測模式下，17次QC樣本經RRLCMS檢測的結果進行PCA分析后，各樣本在第一個主成分上的投影結果。結果表明，17次檢測中前5次的偏差較大，之后9次偏差控制在2SD范圍內。該結果也表明，大批量樣品分析的精密度良好，測試樣本之間的差別主要來自于樣本中代謝物的差異，而不是來自分析方法的誤差，說明代謝組學研究中發現的生物標志物的可靠性。

[TS（] 圖4 17次QC樣本的RRLCMS譜檢測的結果進行PCA分析后，各樣本在第一主成分的投影結果：（A） 正離子檢測模式；（B）負離子檢測模式

Fig．4 PCA results of seventeen quality control （QC） plots using the first component. Datas were acquired based on rapid resolution liquid chromatography （RRLC）MS in （A） positive ion mode and （B） negative ion mode[TS）]

通過方法學考察后，最終確定的血漿前處理方法流程圖如圖解1所示。圖5是采用本方法進行血樣前處理后得到的總離子流色譜圖。

[TS（] 圖解1 最終確定的血漿前處理流程圖

Scheme 1 Flow diagram of plasma preparation eventually applied[TS）]

[TS（] 圖5 RRLCESIMS 檢測得到的血漿樣品總離子流色譜圖. A:正離子模式；B:負離子模式

Fig．5 Typical total ion chromatograms （TICs） obtained from plasma samples by rapid resolution liquid chromatography（RRLC）ESIMS in A: positive mode; B: negative mode[TS）]

3.4 小結

本研究對血漿前處理方法進行了系統考察，尤其是對沉淀溶劑的溫度進行了優化， 結果表明本方法有效、可行。本方法操作簡便，盡可能全面地保留了血漿樣品中的小分子化合物，符合代謝組學的高通量研究的基本要求; 本方法已經成功應用于本課題組食管癌及乳腺癌的血漿樣品代謝組學研究中。

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Plasma Preparation Method for Metabolomics Analysis Based on

Rapid Resolution Liquid ChromatographyMass Spectrometry



XU Jing1， TIAN YaPing1， CHEN YanHua1， ZHANG RuiPing1，

YANG Fen2， SONG YongMei3， Abliz ZEPER*1



1（Institute of Meteria Medica， Chinese Academy of Medical Sciences and

Peking Union Medical College， Beijing 100050）

2（Peking Union Medical College Hospital， Chinese Academy of Medical

Sciences， Beijing 100032）

3（Cancer Institute Cancer Hospital， Chinese Academy of Medical Science and

Peking Union Medical College， Beijing 100021）



Abstract Different methods for plasma preparation in metabolomics analysis were compared in this study. Plasma proteins were either precipitated with four different organic solvents or subjected to solid phase extraction （SPE） on C18boned phase， with consideration to the number of extracted standard compounds. The eluent was subjected to analyze by rapid resolution liquid chromatography （RRLC）MS. The results indicated that acetonitrile could effectively precipitated plasma proteins， and had the best extracting effect. Three fold cold acetonitrile coupled with slow precipitation was optimal. The results， according to the reproducibility， precision and stability of the sample， showed that the method was satisfactory and would be applied in metabolomics analysis of plasma preparation. Furthermore， reproducibility of the method verified by PCA analysis is sufficient to ensure data quality in metabolomics applications by carefully monitoring of the quality control samples randomly inserted among the real sample queue. The method could be applied in the metabolomics study.

Keywords Metabolomics; Plasma preparation method; Rapid resolution liquid chromatographymass spectrometry

（Received 14 April 2011; accepted 24 June 2011）