脫氧核糖核酸-蛋白質相互作用產物的檢測及其在胃癌組織中的應用

摘 要 建立了無膠篩分毛細管電泳激光誘導熒光（Nongel sieving capillary electrophoresis with laser induced fluorescence， NGSCELIF）檢測脫氧核糖核酸（DNA）蛋白質相互作用產物的方法?？疾炝撕Y分介質聚環氧乙烷（Poly （ethylene oxide），PEO）濃度、分離溫度、分離電壓及緩沖液三羥甲基氨基甲烷硼酸 （TrisBorateEDTA，TBE）pH值等條件對pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker和Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S相互作用產物的影響。結果表明，當PEO濃度為0.1%，TBE的pH 為9.0，分離電壓為15 kV，分離柱溫15 ℃時，DNA蛋白質相互作用產物得到有效分離。本方法應用于人胃癌組織p53基因擴增后的PCR產物和從相應組織中提取的蛋白質二者相互作用產物時，檢測效率高，分離效果好。

關鍵詞 脫氧核糖核酸； 蛋白質； 相互作用； 無膠篩分毛細管電泳； 激光誘導熒光檢測； 聚環氧乙烷； 胃癌組織

1 引 言

蛋白質和核酸是構成生命體最為重要的兩類生物大分子，脫氧核糖核酸（DNA）蛋白質相互作用的研究是21世紀生命科學研究的主要課題之一，涉及多學科前沿交叉領域的相關知識和技術方法。過去的研究主要集中在宏觀認識方面，近年來，研究者綜合各種手段并采用先進的儀器在微觀上取得一些可喜的成果[1，2]，但目前仍處于探索階段。弄清DNA蛋白質相互作用的機制，對于了解DNA轉錄調控和基因表達機制，揭示各種生命活動現象具有極其重要的指導作用。

采用無膠篩分毛細管電泳（NonGel sieving capillary electrophoresis，NGSCE）分析核酸和蛋白質已有報道[3，4]，但將其用于DNA蛋白質相互作用的研究較少。研究分子間相互作用是毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）的一個重要應用領域[5～8]，對于一個相互作用體系，只要游離配體（或受體）和結合物之間存在荷質比的差異，理論上講，都可以在電場下將它們分離，而實際的分離效果則取決于CE的模式、電場強度、溫度、毛細管的內壁狀況等因素。在CE研究分子間相互作用中，最常用的檢測手段是紫外和激光誘導熒光（Laser induced fluorescence，LIF），激光誘導熒光通常要比紫外檢測的靈敏度高出10～1000倍，并且CE信號干擾低，但需要進行熒光標記。研究DNA蛋白質相互作用的熒光法，主要是將熒光物質修飾到蛋白質或核酸分子上構成新型熒光標記物質并結合相關儀器而改造成新型的檢測技術，此法對待測物質的濃度要求低，靈敏度高且部分熒光技術可實現對待測物質的動態分析等。Wan等[9]利用毛細管電泳激光誘導熒光（Capillary electrophoresis with laser induced fluorescence，CELIF）技術研究了單鏈DNA結合蛋白質的反應，CELIF結果顯示不同核苷酸標記的熒光探針因與蛋白質結合的強弱不同，使得DNA蛋白質復合物的計量系數不同，從而得以區分。

SYBR Green I和異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）是兩種常用的熒光衍生試劑，前者常用于核酸的標記，后者則用于對蛋白質的標記。本實驗分別以二者為柱前衍生試劑， PEO為篩分介質[10]， 1×TBE為電泳緩沖溶液，對DNA和蛋白質進行NGSCE分析。以SYBR Green I標記DNA標準物（pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker（26～501 bp））和蛋白質標準物（Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S（6.5～200 kDa））共同孵育后的混合物，以DNA和蛋白質標準物為材料，對DNA蛋白質相互作用產物的方法學及實驗條件進行考察，將其用于提取的胃癌組織基因和蛋白質相互作用產物的檢測，探討DNA蛋白質相互作用的機制，并以DNA為“誘餌”，得到一種檢測蛋白質的方便、有效、快速的方法。

2 實驗部分 

2.1 儀器與試劑

P/ACE System 5000型毛細管電泳儀（美國Beckman公司），激光檢測器波長為488 nm ；石英毛細管柱（河北永年光導纖維廠）； PHS3C型酸度計（上海雷磁儀器廠）；AE240型電子天平（Mettler，瑞士）；磁力攪拌器（深圳天南海北實業有限公司）。

聚環氧乙烷 （PEO，Mw＝300000）；γ甲基丙烯?；踩籽趸┕柰椋∕APS，A Johson Matthey公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，上海山浦化工有限公司）；硼酸（Boric acid）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（天津化學試劑廠）；與氬離子激光器（λex＝488 nm，λem＝520 nm） 匹配的熒光試劑SYBR Green I 和FITC分別購自廈門百維信公司和北京鼎國生物技術有限責任公司；Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S（TaKaRa）\\，pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker、PCR反應試劑、動物組織基因組提取試劑盒、UNIQ10柱式PCR產物純化試劑盒和蛋白質提取非變性裂解液試劑盒均購自上海生物工程技術有限公司。實驗所用試劑均為分析純。

胃癌組織標本取自蘭州軍區蘭州總醫院病理科，標本均經胃部切除并經病理切片證實。

2.2 組織DNA的提取、目的基因的擴增及標記

利用動物組織基因組提取試劑盒提取胃癌組織基因組DNA，PP5.0軟件設計p53基因包含282位密碼子突變位點的引物，引物由上海生物工程技術有限公司合成。上游引物：5′TCACTGAGTTCGCCAAGAGCAT3′；下游引物：5′ATCACTGAAGGGTTTGCGGAGG3′。PCR擴增反應體系25

SymbolmA@ L中含dNTP 200

SymbolmA@ mol/L、TaqDNA 聚合酶0.5 U/

SymbolmA@ L、引物0. 05

SymbolmA@ mol/L、DNA 模板20 mg/L。PCR擴增條件：94 ℃變性30 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環。PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以SYBR Green I對DNA標準物和胃癌組織p53基因PCR產物進行標記，SYBR Green I:DNA＝1∶5，室溫避光標記30 min，取標記混合物進行CE檢測。

2.3 蛋白質的提取及標記

取胃癌組織10～50 mg，充分剪碎，置于Epdoff管中，利用動物組織蛋白質提取試劑盒提取胃癌組織蛋白質，在－40 ℃冰箱保存備用。

用FITC對蛋白質標準物和胃癌組織蛋白質進行標記，FITC:蛋白質＝1∶100，室溫避光標記4 h，取標記混合物進行CE檢測。

2.4 DNA和蛋白質的共同孵育及標記

取適量DNA和蛋白質標準物，在pH 9緩沖溶液中37 ℃共同孵育4 h，然后加入SYBR Green I標記，30 min后，對標記混合液進行CE檢測。胃癌組織樣品采用相同的方法進行處理。

2.5 毛細管電泳檢測

為了抑制電滲流并減少毛細管內壁對分離物的吸附，提高遷移時間的重現性，對毛細管柱內壁進行涂層修飾[11]。涂層毛細管柱長37 cm×75

SymbolmA@ m，有效長度27 cm，使用前以水和1×TBE分別沖洗5 min，再用毛細管電泳儀壓力系統自動填充篩分介質PEO溶液，以1×TBE為緩沖液進行毛細管電泳LIF檢測（λex＝488 nm，λem＝520 nm），10 s負極電動進樣，進樣電壓10 kV，P/ACE System station數據處理軟件采集數據。

CE分離pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker的最佳條件同文獻[12]: 3.0% PEO，1×TBE（pH 8.3），電壓15 kV，溫度15 ℃；CE分離Protein Molecular Weight （Broad） D532S的最佳條件同文獻[13]：PEO的濃度0.05%，電泳溫度15 ℃，分離電壓15 kV和緩沖液pH值10.0；CE分離DNA、蛋白質和二者結合物時所用1×TBE緩沖液的pH分別為8.3，10.0和9.0，緩沖液的組成為89 mmol/L Tris， 89 mmol/L硼酸和2 mmol/L EDTA。

取適量已標記好的DNA蛋白質相互作用的混合物進行CE檢測，考察二者相互作用產物分離的最佳條件。

3 結果與討論

3.1 DNA標準物和蛋白質標準物的CE檢測結果

3.1.1 DNA標準物的CE檢測 利用CE分離pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA 標準物，由圖1可見，背景信號低，分離效果好，分離時間短，電泳在13 min內完成，所有DNA片段均得到基線分離。

3.1.2 蛋白質標準物的CE檢測 CE分離Protein Molecular Weight （Broad） D532S的結果見圖2，蛋白質標準物在最佳檢測條件下，13 min內完成電泳分離過程。由于FITC作熒光標記物分離蛋白質時，在堿性條件下熒光較強，雜峰干擾減少，因而不同分子質量的蛋白都得到基線分離。

[TS（] 圖1 毛細管電泳分離pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA 標準物

Fig．1 Electropherograms of pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker separation by CE

1～11: 26， 34， 67， 110111， 147， 190， 242， 331， 404， 489， 501 bp．[TS）]

[TS（] 圖2 毛細管電泳分離蛋白質分子量標準物 （Broad） D532S

Fig．2 Capillary electrophoresis traces of protein molecular weight marker （Broad） D532S

1～9: 6.5， 14.3， 20.1， 29.0， 44.3， 66.4， 97.2， 116， 200 kDa.[TS）]

3.2 DNA標準物和蛋白質標準物相互作用產物的CE條件優化

3.2.1 PEO濃度對分離的影響 水溶性聚合物PEO溶液可以吸附到毛細管內壁上形成一層能降低電滲流，且具有篩分功能的動態涂層[14]。將PEO固體溶于TBE中，配制成一系列濃度分別為0.05%，0.1%，0.2%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的篩分介質，在分離電壓15 kV，溫度15 ℃，pH＝9.0時，考察不同濃度PEO對DNA蛋白質標準物相互作用物的分離效果（圖3）。較低濃度的PEO不具有篩分效果，PEO濃度為0.05%時，樣品不能有效分離；PEO濃度為0.1%時，產生了篩分效應較好的分離效果；此后增加PEO濃度，篩孔縮小，位阻效應增強，遷移時間延長，DNA蛋白質相互作用產物的分離效果變差。因此選擇0.1% PEO作為篩分介質研究DNA蛋白質之間的相互作用產物。[TS（] 圖3 不同濃度PEO分離DNA蛋白質標準物相互作用產物的電泳圖

Fig．3 Capillary electrophoresis traces of DNAProtein Marker interaction products separation under different poly （ethylene oxide）（PEO）concentration （a. 0.05%； b. 0.1%； c. 1.5%； d. 3.0%）[TS）]

3.2.2 溫度對分離的影響 溫度是影響緩沖液粘度的主要因素。通常溫度越高，遷移時間越短，分離度下降，柱效降低。溫度可影[TS（] 圖4 不同溫度時分離DNA蛋白質標準物相互作用產物的電泳圖

Fig．4 Capillary electrophoresis traces of DNAprotein marker interaction products separation at different temperatures

a. 15 ℃； b. 20 ℃．[TS）]響緩沖液的pH值，進而間接影響蛋白質所帶電荷，緩沖液TBE對溫度變化比較敏感，而且溫度的改變可能會改變蛋白質的空間結構，影響DNA蛋白質相互作用產物的分離。當溫度為15 ℃時，電泳呈現多個峰（圖4），能更全面反映二者的相互作用本質，但溫度繼續升高時，電泳峰數目減少，分離時間縮短。溫度過高會導致較大電流波動，確定適宜分離溫度為15 ℃。

3.2.3 電壓對分離的影響 電壓主要影響分離的效率及效果，低電壓時分離時間較長，峰高較低。隨著電壓的增加，各組分的遷移時間縮短，樣品峰高隨之增加，但繼續提高電壓，可因電壓過高致使電流過大，個別峰不能分離，分離效果變差（圖5）。綜合考慮遷移時間及分離效果，最佳分離電壓選擇為15 kV。

[TS（] 圖5 不同電壓下毛細管電泳分離DNA蛋白質標準物相互作用產物的電泳圖

Fig．5 Capillary electrophoresis traces of DNAProtein Marker interaction products separation under different voltage

（a. 10 kV； b. 15 kV； c. 20 kV； d. 25 kV）．[TS）]

3.2.4 pH值對分離的影響 緩沖液的pH值是影響CE分離效果的主要因素，它決定電泳過程運行的穩定狀況以及被分離物的穩定性。配制pH值分別為6.0～10.0的TBE緩沖溶液，對影響DNA蛋白質相互作用物分離效果的pH值進行了優化。當pH＝10.0時，DNA和蛋白質分別能被最佳分離的8.3和，DNA蛋白質相互作用物不能得到分離；當模擬人體生理條件（pH 7.5）分離二者時，出現4個樣品峰，但不能達到基線分離。實驗選擇緩沖液最佳pH值為9.0（圖6），分離效果較好。

[TS（] 圖6 不同pH值TBE分離DNA蛋白質標準物相互作用產物電泳圖

Fig．6 Capillary electrophoresis traces of DNAProtein Marker interaction products under different pH of trisBorateEDTA (TBE) buffer

a. 7.5； b. 8.3； c. 9.0； d. 10.0．[TS）]

3.3 樣品分析

3.3.1 樣品DNA和蛋白質的CE檢測 參考文獻[12，13]方法，分別對樣品DNA和蛋白質進行分離分析。樣品DNA為提取的胃癌組織p53基因PCR擴增產物經純化后的產物，樣品蛋白質為提取的胃癌組織蛋白質混合物，結果見圖7。圖7a為樣品DNA的CE圖，其出峰時間約11 min；圖7b為樣品蛋白質的CE圖，由于提取的蛋白質為混合物，有多個樣品峰出現，在15 min內完成分離。

[TS（] 圖7 毛細管電泳檢測胃癌組織p53基因PCR產物和蛋白質混合物以及二者相互作用產物

Fig．7 Result of the p53 gene fragment， protein complex， and p53protein interaction products detection of gastric cancer tissue （a）. p53 gene fragment， （b）. protein complex， （c）. p53protein interaction products[TS）]

3.3.2 樣品DNA蛋白質相互作用產物的CE檢測 將優化得到的CE檢測DNA蛋白質標準物相互作用產物的最佳分離條件用于3.3.1樣品的分析，結果見圖7c。目的基因p53基因包含282位密碼子突變位點的一段約200 bp的DNA序列，p53基因突變伴隨突變型p53蛋白的聚積，由于突變型p53蛋白穩定性增加，因而易于檢測[14]。結合DNA和蛋白質Marker的遷移CE圖，將樣品DNA和蛋白質單獨進樣時的CE圖與二者相互作用產物的CE圖對比后發現，與目的基因片段結合的蛋白質分子量大約在44～66 kDa，推測可能是p53基因的表達蛋白。另外，蛋白質與DNA相互作用后，還可能出現結合后核質比相近而難以分開的情況，此時需要結合出峰時間進一步判斷，必要時用傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）方法進行檢測，將與特定基因片段結合的蛋白質從PAGE膠上回收，結合質譜等手段得到蛋白質的信息，并在此基礎上進一步論證二者相互作用的方式及其機理。

3.4 小結

考察了NGSCE分離pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker和Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S相互作用產物的最佳實驗條件，并用于分析胃癌組織DNA蛋白質相互作用產物的檢測， 效果較好。

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Detection Method of Deoxyribonucleic AcidProtein 

Interaction Products and Its Application in Gastric Cancer Tissue

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ZHANG AiMei1，2， SUN Kun*1， WANG Rong*3， XIE Hua3， XIE XiHui 3， SHI YouQin3

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1（College of Chemistry and Chemical Engineering， Northwest Normal University， Lanzhou 730070）

2 （College of Life Science， Northwest Normal University， Lanzhou 730070）

3 （Department of Pharmacy， Lanzhou General Hospital of the Chinese People′s Liberty Army， Lanzhou 730050）



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Abstract A method was established to separate DNAprotein interaction products by nongel sieving capillary electrophoresis with laser induced fluorescence （NGSCELIF）. A series of effects on CE were studied， namely sieving medium concentration， separation temperature， separation voltage， pH value of TrisBorateEDTA （TBE） buffer. The results indicated that pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA marker and protein molecular weight marker （Broad） D532S interaction products were effectively separated when sieving medium was 0.1% （w/V） poly （ethylene oxide） （ 300000）， electrophoresis buffer was 1×TBE （pH9.0）， separation voltage was 15 kV， and temperature was 15 ℃. The detection method of DNAprotein interaction products was used to analyze the interaction of the products of PCR of p53 gene and protein complex from gastric cancer tissue. The method has high detection rate and good separation efficiency.

Keywords Deoxyribonucleic acid; Protein interaction; Nongel sieving capillary electrophoresis; Laserinduced fluorescence detection; Poly（ethylene oxide）; Gastric cancer tissue

（Received 9 March 2011; accepted 23 June 2011）