液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定果蔬中4種新型卵菌綱殺菌劑殘留

摘 要 建立了蔬菜和水果中噻唑菌胺、苯噻菌胺、氟啶酰菌胺和雙炔酰菌胺4種新型卵菌綱殺菌劑的分散固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈均質(zhì)提取，混合使用乙二胺N丙基硅烷（PSA）和ODS C18N兩種基質(zhì)分散凈化劑凈化，采用液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（LC/MS/MS）檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)建立校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以消除基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，噻唑菌胺和氟啶酰菌胺在1～100

SymbolmA@ g/L，苯噻菌胺和雙炔酰菌胺在0.5～50

SymbolmA@ g/L線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9994～0.9999； 4種卵菌綱殺菌劑添加回收率在80.9%～101.3%之間； 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于6.3%。定量限在0.53～1.3

SymbolmA@ g/kg之間，檢出限為0.16～0.40

SymbolmA@ g/kg。

關(guān)鍵詞 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 果蔬； QuEChERS方法； 噻唑菌胺； 苯噻菌胺； 氟啶酰菌胺； 雙炔酰菌胺

1 引 言

卵菌綱真菌是一種破壞性強(qiáng)、危害性大的植物病原菌，可引發(fā)瓜果腐爛病，馬鈴薯、番茄晚疫病，葡萄、瓜類霜霉病及十字花科白銹病等多種蔬菜和水果病害，對(duì)其產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重影響?yīng)?］。甲霜靈、苯霜靈、乙磷鋁、霜脲氰等殺菌劑是國(guó)內(nèi)現(xiàn)在使用較多的卵菌綱病原菌殺菌劑，多年連續(xù)使用，產(chǎn)生的抗性已相當(dāng)嚴(yán)重，應(yīng)用受到了很大的限制。近幾年，國(guó)外很多農(nóng)藥公司成功開(kāi)發(fā)了一些酰胺類殺菌劑新品種，主要包括噻唑菌胺、苯噻菌胺、氟啶酰菌胺和雙炔酰菌胺。這些新型殺菌劑均具有獨(dú)特的作用方式，與甲霜靈及其它殺菌劑無(wú)交互抗性，而且具有很好的持效活性，安全性高，有良好的應(yīng)用前景［2～7］。

隨著這些新型酰胺類殺菌劑的登記、推廣和使用，作為我國(guó)蔬菜和水果主要出口市場(chǎng)的日本、美國(guó)和歐盟等國(guó)均對(duì)其制定了或擬制定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。但上述4種新型殺菌劑殘留分析方法的報(bào)道較少［8～11］。本研究參照QuEChERS前處理的分散固相萃取技術(shù)［12］，同時(shí)采用PSA和ODS C18N的混合吸附劑對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，ODS C18N彌補(bǔ)了PSA不吸附油脂、色素等弱極性雜質(zhì)的缺點(diǎn)，使凈化更為充分。將此前處理方法結(jié)合HPLC/MS/MS應(yīng)用于蔬菜和水果中噻唑菌胺、苯噻菌胺、氟啶酰菌胺和雙炔酰菌胺的同時(shí)定性確證和定量檢測(cè)，取得了滿意的結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200 快速液相色譜儀、6410 Triple Quad 質(zhì)譜儀（美國(guó)Aglient公司）；5810R型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；ULTRATURRAX T18 basic型均質(zhì)器、MS 3基本型旋渦混合器（德國(guó)IKA公司）；MilliQ超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

氟啶酰菌胺（純度≥99.0%）、苯噻菌胺（100 mg/L）、雙炔酰菌胺（100 mg/L）和噻唑菌胺（10 mg/L）標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；乙腈（色譜純，TEDIA公司）；甲酸（色譜純，Riedelde Han公司）；HCl（優(yōu)級(jí)純，萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；NaCl、無(wú)水MgSO4（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），用前在450 ℃烘干5 h，200 ℃時(shí)取出冷卻備用；十八烷基鍵合相硅膠（ODS C18N）凈化劑、乙二胺N丙基硅烷（PSA）凈化劑（Agela Technologies公司）。

2.2 樣品處理

取試樣可食用部分，粉碎并混合均勻，準(zhǔn)確稱取10 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈溶液，3.0 g無(wú)水MgSO4，2.0 g NaCl，均質(zhì)提取。以5000 r/min離心5 min。吸取2.0 mL上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至裝有100 mg ODS C18N、100 mg PSA粉末的離心管中，渦旋2 min，以5000 r/min離心5 min。取0.5 mL上清液于進(jìn)樣小瓶中，然后準(zhǔn)確加入0.5 mL 0.1%甲酸溶液，渦旋，溶液經(jīng)0.22

SymbolmA@ m濾膜過(guò)濾后待測(cè)。取空白樣品，按上述提取和凈化過(guò)程進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用此基質(zhì)溶液和0.1%甲酸稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

Agilent ZORBAX SBC18柱（100 mm×2.1 mm×1.8

SymbolmA@ m）；Agilent RRLC在線過(guò)濾器（2.1 mm×0.2

SymbolmA@ m）；流動(dòng)相：A液為乙腈溶液，B液為0.1%甲酸溶液，以體積比50∶50等梯度洗脫；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5

SymbolmA@ L。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

研究發(fā)現(xiàn)，苯噻菌胺、氟啶酰菌胺和雙炔酰菌胺在SBC18柱保留較強(qiáng)，以甲醇＋0.1%甲酸、甲醇＋5 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，等度和梯度洗脫均不能實(shí)現(xiàn)上述3種化合物的分離，保留時(shí)間也較長(zhǎng)。以乙腈＋0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，采用體積比50∶50等梯度洗脫時(shí)，可實(shí)現(xiàn)本研究中的4種酰胺類農(nóng)藥的快速分析，每種化合物色譜峰對(duì)稱尖銳，分離效果較好。因此，選擇使用乙腈＋0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，體積比50∶50等梯度洗脫。

3.2 母離子和子離子的選擇



采用1 mg/L待測(cè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以流動(dòng)注射的方式進(jìn)行母離子全掃描，確定每種農(nóng)藥的母離子質(zhì)量數(shù)。采用0.1 mg/L待測(cè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別對(duì)毛細(xì)管出口電壓進(jìn)行優(yōu)化，從中選出豐度最高的毛細(xì)管出口電壓作為最佳毛細(xì)管出口電壓。然后分別對(duì)子離子及碰撞能力進(jìn)行優(yōu)化，從中選出豐度最高的碰撞能量作為最佳碰撞能量，選擇兩個(gè)豐度比較高的子離子作為定性和定量離子，建立多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，4種卵菌綱殺菌劑的質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2（氟啶酰菌胺選擇了2個(gè)母離子），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖見(jiàn)圖1。

3.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

ESI源容易受樣品基質(zhì)的影響。樣品基質(zhì)對(duì)離子化有抑制作用，不同農(nóng)藥受同一樣品基質(zhì)影響不同，不同樣品基質(zhì)對(duì)同一農(nóng)藥離子化的抑制情況也存在差異。噻唑菌胺和苯噻菌胺的離子化效率受樣品基質(zhì)影響較小；氟啶酰菌胺和雙炔酰菌胺離子化效率受樣品基質(zhì)抑制較強(qiáng)。草莓和葡萄對(duì)農(nóng)藥離子化影響較弱，黃瓜和大蔥對(duì)農(nóng)藥離子化影響較強(qiáng)。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，以空白樣品提取液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)樣和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質(zhì)效應(yīng)。

3.4 提取條件的選擇

選擇提取劑的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以乙酸乙酯提取，會(huì)提取出更多的色素，對(duì)化合物離子化抑制更強(qiáng)；以乙腈提取，再利用鹽析效應(yīng)去除水分，無(wú)需加入大量無(wú)水MgSO4，因此選擇使用乙腈作為提取劑。

本研究比較了使用10 mL乙腈對(duì)10 g樣品進(jìn)行均質(zhì)提取時(shí)，分別加入不同量的無(wú)水MgSO4，NaCl， 無(wú)水MgSO4＋NaCl對(duì)乙腈提取劑體積的影響。實(shí)驗(yàn)表明，分別加入3， 5和7 g NaCl均質(zhì)提取時(shí)，乙腈提取液體積均接近7.0 mL。分別加入3和5 g無(wú)水MgSO4提取時(shí)，乙腈提取液體積約為10 mL。加入5 g無(wú)水MgSO4＋2 g NaCl、3 g無(wú)水MgSO4＋2 g NaCl均質(zhì)提取時(shí)，乙腈提取液體積為8.0 mL。加入NaCl均質(zhì)提取的樣品液中不含有水分；而僅加入無(wú)水NaCl提取時(shí)，提取液中含有一定量的水。考慮到無(wú)水NaCl的去水放熱反應(yīng)可以加速相之間的分離［13，14］。確定乙腈均質(zhì)提取時(shí)加入3 g無(wú)水MgSO4＋2 g NaCl。

研究表明，10和20 mL乙腈對(duì)4種卵菌綱殺菌劑的提取回收率無(wú)任何差異。但使用乙腈0.1%甲酸， 即采用流動(dòng)相定容時(shí)，色譜峰峰型更尖銳對(duì)稱。因此確定使用10 mL乙腈提取樣品殘留的農(nóng)藥，凈化后，取0.5 mL提取凈化液，加入0.5 mL 0.1%甲酸溶液定容后上機(jī)測(cè)定。

3.5 凈化條件的選擇

基質(zhì)分散凈化常用的凈化劑有乙二胺N丙基硅烷（PSA）粉、十八烷基鍵合相硅膠（ODS C18N）粉、石墨炭黑（CARB）粉和氨基（NH2）粉。PSA去除脂肪酸效果較好，在去除色素、甾醇和維生素方面效果一般，而ODS C18N和石墨炭黑除維生素、色素、甾醇的能力較好； 氨丙基粉與PSA粉凈化范圍一致，但離子交換能力較PSA弱。

上述凈化劑在去除雜質(zhì)的同時(shí)也可能對(duì)目標(biāo)化合物產(chǎn)生吸附， 4種卵菌綱殺菌劑混和標(biāo)準(zhǔn)溶液分別經(jīng)4種吸附劑處理后的回收率見(jiàn)表2。

從表2可見(jiàn)，ODS C18N粉、PSA粉、NH2粉對(duì)4種農(nóng)藥幾乎無(wú)吸附。CARB粉對(duì)4種農(nóng)藥均有一定程度的吸附作用。綜合凈化劑去雜特性和對(duì)目標(biāo)化合物的吸附情況，選擇100 mg ODS C18N粉和100 mg PSA粉對(duì)其進(jìn)行凈化。

3.6 方法的線性范圍和檢出限

將空白樣品按上述提取和凈化過(guò)程進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取凈化液。用此基質(zhì)溶液和0.1%甲酸將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成濃度為1～100

SymbolmA@ g/L和0.5～50

SymbolmA@ g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，LC/MS/MS進(jìn)樣分析后，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表3。

以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N＝3和樣品處理過(guò)程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出方法檢出限（LOD）。以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時(shí)，取信噪比S/N＝10和樣品處理過(guò)程的稀釋倍數(shù)計(jì)算得出定量限（LOQ）。4種卵菌綱殺菌劑在黃瓜基質(zhì)中的方法檢出限見(jiàn)表3。

3.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)購(gòu)自當(dāng)?shù)爻械狞S瓜、番茄、葡萄樣品和日常檢測(cè)的大蔥及草莓樣品進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)樣品30批，其中黃瓜陽(yáng)性樣品2批，分別為19.9和13.5

SymbolmA@ g/kg。

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Determination of New Type of 4 Bactericids Used for Control of

Oomycete Diseases Residues in Fruits and Vegetables by Liquid

Chromatography/Tandem Mass Spectrometry



CUI ShuHua1，2， XU MeiLing2， QIAN JiaLiang2， DUAN Hao2，

LIU JingFeng2， LIN LiMing3， WANG KaiYun*1

1（College of Plant Protection， Shandong Agriculture University， Taian 271018）

2（Inspection and Quarantine Technology Center of Linyi Exit/Entry Inspection and Quarantine Bureau， Linyi 276034）

3（Shangdong Inspection Quarantine and Sdence Technology Academy， Qingdao 266002）=

Abstract A method was developed for the determination of ethaboxam， benthivalicarbisopropyl， fluopicolide and mandipropamid in fruits and vegetables. The analytes were extracted from the samples by acetonitrile， and purified by dispersion solid phase extraction using ODS C18N and PSA as solidphase， and then analyzed by LC/MS/MS with multiple reaction monitoring （MRM）. The interference of matrix was reduced by the matrixmatched calibration standards curve. The linear range was from 1

SymbolmA@ g/L to 100

SymbolmA@ g/L for ethaboxam， fluopicolide， from 0.5

SymbolmA@ g/L to 50

SymbolmA@ g/L for benthivalicarbisopropyl， mandipropamid （r≥0.9994）. The fortified recoveries were from 80.9% to 101.3% with relative standard deviations （RSD） lass than 6.3%. The limits of quantification were 0.53

SymbolmA@ g/kg to 1.3

SymbolmA@ g/kg and the limit of detection were 0.16 to 0.40

SymbolmA@ g/kg.

Keywords Liquid chromatographytandem mass spectrometry; Fruits and vegetables; Ethaboxam; Fluopicolide; Benthivalicarbisopropyl; Mandipropamid

（Received 22 December 2010; accepted 4 May 2011）