陰/陽離子交換色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析魚和貝類海產(chǎn)品砷的形態(tài)

摘 要 采用陰（Hamilton PRPX100柱）陽（Dionex Ionpac CS10柱）離子交換色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分別以pH 10.3的20 mmol/L NH4HCO3和pH 2.0的5 mmol/L吡啶溶液為流動(dòng)相，建立了三價(jià)砷As、五價(jià)砷As、一甲基砷酸（MMA）、二甲基砷酸（DMA）、砷甜菜堿（AsB）、砷糖（PO4， OH， SO3， SO4）砷形態(tài)的分析方法。采用微波消解法和超聲溶劑提取法對我國不同海域9種魚和貝類海產(chǎn)品進(jìn)行前處理，對砷含量及其化學(xué)形態(tài)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)表明，魚和貝海產(chǎn)品主要砷形態(tài)為砷甜菜堿AsB，其含量占可提取砷的42.8%～99.4%，大多數(shù)貝類樣品含有砷糖PO4、砷糖OH，其含量分別占可提取砷的32.5%～57.1%和1.4%～3.3%，少數(shù)樣品含有DMA，其含量分別占可提取砷的5.7%～25.0%， 所有樣品無機(jī)砷的濃度均低于可提取砷的2.0%。在魚和貝類海產(chǎn)品中，含砷化合物主要是毒性較低的有機(jī)砷，不會(huì)對人的健康帶來危害。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜； 砷； 形態(tài)分析； 魚和貝類海產(chǎn)品

1 引 言

海洋生物中砷化物含量較高，是人體攝入砷的重要來源[1]。研究表明，砷的毒性與其存在的形態(tài)密切相關(guān)。以砷化物的半致死劑量LD50計(jì)，其毒性依次為H3As＞As ＞As ＞一甲基砷酸（MMA）＞二甲基砷酸（DMA）＞三甲基砷氧化物（TMAO）＞砷糖＞砷膽堿（AsC）＞砷甜菜堿（AsB），可見無機(jī)砷的毒性最大，而有機(jī)砷的毒性較小，而AsC和AsB被認(rèn)為是無毒的[2]。因而傳統(tǒng)的元素總濃度的測定已經(jīng)不能滿足評估砷的暴露或攝入對人體健康的影響，砷的毒性研究應(yīng)該從砷的形態(tài)入手，區(qū)分海產(chǎn)品無機(jī)砷和有機(jī)砷化物，特別在砷的循環(huán)與轉(zhuǎn)化過程中起重要作用的砷糖[3]，以及無毒的砷膽堿和砷甜菜堿對于評價(jià)海產(chǎn)品安全性非常重要。

砷的形態(tài)分析主要采用液相色譜分離與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）[2]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICPAES）、原子熒光光譜（AFS）[4]、原子吸收光譜（AAS）等聯(lián)用技術(shù)[5]。ICPMS具有靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，已成為砷形態(tài)分析中最具前景的聯(lián)用方法之一[6]。Larsen等[7]采用陰陽離子交換色譜成功分離8種不同形態(tài)砷的化合物，但不能分離4種砷糖； Madesn等[8]采用陰離子交換色譜分離4種形態(tài)砷的標(biāo)準(zhǔn)化合物和Fucus抽取物，并采用LCESMS（電噴霧質(zhì)譜）確定四種砷糖結(jié)構(gòu)，但As與一種砷糖保留時(shí)間相同。本實(shí)驗(yàn)采用陰離子交換色譜（Hamilton PRPX100柱）和陽離子交換色譜（Dionex Ionpac CS10柱）與ICPMS聯(lián)用技術(shù)，建立了9種不同形態(tài)砷的化合物的分析方法，對我國不同海域9種魚（黃魚、帶魚、三文魚、鱈魚）和貝（螃蟹、蝦、牡蠣、蟶子、蚌）海產(chǎn)品中砷含量及其化學(xué)形態(tài)進(jìn)行分析檢測。在所有分析樣品萃取物中AsB為砷的主要形態(tài)，無機(jī)砷的濃度低于總砷的2%。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Elan 6000 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICPMS， 美國PE 公司）； Alltech Model 526 泵（Deerfield，1L， 美國）； Model 9010金屬閥，50

SymbolmA@ L進(jìn)樣管（Rheodyne， Cotata， CA，美國）；Ionpac CS10 陽離子交換柱（美國Dionex公司）； PRPX100陰離子交換柱（美國Hamilton公司）；XYJ801型離心機(jī)（上海精密儀器儀表有限公司），MDS2002A微波消解儀（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）。

吡啶（上海試劑廠）; NH4HCO3（北京試劑廠）; 甲醇（天津四有生物試劑廠）; HNO3（北京試劑廠）; Na2HAsO4#8226;7H2O儲(chǔ)備液（Sigma， St. Louis，MO，USA），一甲基砷酸（MMA）， 二甲基砷酸（DMA）（Commission of the European Communities， Standard， Measurement and Testing Programme）； Kelp粉末（Brirkbeck College， University，UK）; 砷糖PO4和砷糖OH（作者從天然物質(zhì)中分離），魚和貝樣品（超市購買），所用試劑均為分析純。水為18 MΩ超純水。不同形態(tài)的砷的化學(xué)結(jié)構(gòu)見文獻(xiàn)[8]。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品的萃取與硝化 取適量魚和貝類肌肉組織用粉碎機(jī)粉碎，稱取5.000 g于聚四氟乙烯管中，加入10 mL甲醇水（1∶1，V/V），超聲20 min后離心10 min，吸取萃取液于50 mL燒杯中，重復(fù)萃取4次，合并萃取液，在電熱板上30 ℃蒸干，以10 mL去離子水溶解，保存在4 ℃冰箱中，用于分析砷形態(tài)。

稱取1.0000 g的魚和貝類海產(chǎn)品肌肉組織于聚四氟乙烯（Teflon）離心管中，加入3 mL HNO3和1 mL H2O2，擰松離心管帽于750 W微波消解3～4 min。再重復(fù)兩次，每次間隔冷卻10 min，清澈的樣品液以去離子水定容10 mL，用于總砷檢測[10]。

2.2.2 總砷的測定 以9 mL 1% HNO3稀釋1 mL被硝化的樣品，ICPMS測定萃取前后魚和貝類海產(chǎn)品中的總砷，187Re為內(nèi)標(biāo)，以砷的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

以標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)BCRCRM 627（比利時(shí)標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)及計(jì)量學(xué)會(huì)提供）考察方法的準(zhǔn)確度，標(biāo)準(zhǔn)參考值為（4.8±0.3） mg/kg As，方法測定值為5.0±0.3 mg/kg As。在標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)中分別加入2 ng/L的As， As， MMA和DMA，平行3次測得平均回收率分別為96%， 101%， 95%和100%。

對比色譜圖1和圖2，AsB和砷糖OH的保留時(shí)間均為170 s，但無論怎樣改善流動(dòng)相的濃度與酸度，AsB和砷糖OH都不能被分離。選用Dionex Ionpac CS10 （250 mm×4 mm id， 10

SymbolmA@ m）陽離子色譜柱，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L吡啶（pH 2.0， 以HNO3調(diào)節(jié)）為流動(dòng)相能成功分離4種砷的化合物砷糖PO4，DMA，AsB和砷糖OH，其保留時(shí)間分別為103， 138， 224和474 s，見色譜圖3。

在pH 2.0的酸性流動(dòng)相系統(tǒng)中，DMA、砷糖PO4和砷糖OH將被質(zhì)子化，形成As＋OH結(jié)構(gòu)[13]。同是質(zhì)子化的陽離子結(jié)構(gòu)，砷糖OH保留時(shí)間最長，而砷糖PO4保留時(shí)間最短。這是因?yàn)樵谏樘荘O4中的磷酸部分含有一個(gè)易解離的氫原子，隨著氫原子的解離，砷糖PO4將可能變成陰離子結(jié)構(gòu)，使得其具有兩性離子特征， As＋OH中正電荷發(fā)生弱化，致使砷糖PO4保留時(shí)間最短。

所有被分析樣品均檢出AsB，結(jié)果見表3。AsB在一種螃蟹中濃度最高（6.60 mg/kg，濕重），其次是黃魚（1.73 mg/kg，濕重），而在其它樣品中的分布相對較為均勻。在魚類樣品（除三文魚外）中，AsB的含量高于可提取砷的96.0%。AsB是穩(wěn)定性較好的化合物，其在人體中不能代謝，直接被排除體外，不會(huì)危害人體健康[14]。而貝類樣品則含有多種砷的化合物。在雙殼類（牡蠣、蟶子和蚌）樣品中，砷糖PO4含量較高，為可提取砷的13.8%～57.1%，而AsB為可提取砷的42.8%～82.6%，遠(yuǎn)低于魚類樣品。砷糖OH在所有雙殼類樣品中被檢測，其含量為可提取砷的1.4%～3.3%。

盡管砷糖沒有細(xì)胞毒性和誘變性，但當(dāng)人攝入砷糖含量較高的海產(chǎn)品后，砷糖被代謝為DMA，而DMA的毒性高于砷糖[15]。DMA僅在三文魚、蝦和牡蠣樣品中被檢出，其含量分別為可提取砷的25.0%， 7.4%和1.4%。在1個(gè)蟶子樣品中，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未知砷的化合物（見圖4），其含量為其可提取砷的6.5%。但在其它樣品中均未檢出。

3.3 小結(jié)

研究的9種魚和貝類海產(chǎn)品中含砷化合物主要為AsB，砷糖PO4、砷糖OH 和DMA。其中AsB為最主要的形態(tài)，在魚類樣品（三文魚除外）中含量高于可提取砷的96.0%。在雙殼貝類樣品中AsB的含量為可提取砷的42.8%～82.6%，因?yàn)樵谶@類樣品中還含有一定量的砷糖。DMA僅在少數(shù)幾個(gè)樣品（三文魚、蝦、蟶子）中被檢測，在三文魚中的含量較高，為總可提取砷的25.0%，在所有樣品中都檢測到無機(jī)砷，但其含量低于可提取砷的2.0%。綜上所述，魚和貝類海產(chǎn)品中主要砷的化合物為有機(jī)砷，其毒性很低，因此，食用魚和貝類海產(chǎn)品是安全的。但是，由于砷糖在人體內(nèi)的代謝物為DMA，其毒性遠(yuǎn)大于砷糖，因此評估攝入這類海產(chǎn)品的毒性時(shí)必須關(guān)注砷化合物形態(tài)轉(zhuǎn)變所帶來的毒性變化的影響。

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Analysis of Arsenic Speciation in Sea Fish and Shellfish by Anion/Cation

Exchange High Performance Chromatography Coupled with

Inductively Coupled PlasmaMass Spectrometry

LI WeiHua*， LIU YuHai

（School of Chemistry and Chemical Engineering， Jiangsu Teachers′ College of Technology， Changzhou 213001）

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Abstract The separation of arsenic compounds， including As， As， monomethylarsonate （MMA）， dimethylarsonate （DMA）， arsenobetaine （AsB）， arsenosugar PO4， arsenosugar OH， arsenosugar SO3 and arsenosugar SO4 were carried out in Hamilton PRPX100 anionexchange column with a mobile phase of 20 mmol/L NH4HCO3 （pH 10.3） and on a Dionex Ionpac CS10 cationexchange column with a mobile phase of 5 mmol/L pyridinium （pH 2.0） for their analysis by ICPMS. Total content of As and its different species of eight types of fish and shellfish in microwaveassisted digestion and ultrasonic solvent extraction were examined. The results showed that main components in all of the extracted fish and shellfish samples were arsenobetain（42.8%－99.4%）， while arsenosugar PO4 and arsenosugar OH were detected in most extracted shellfish samples（32.5%－57.1%， 1.4%－3.3%）， DMA was detected in a few extracted samples（5.7%－25.0%）. In contrast， no inorganic arsenic in fish and shellfish samples occurred at levels below 2.0%. 

Keywords High preferment liquid chromatographymass spectrometry; Arsenic speciation; Fish and shellfish

（Received 30 March 2011; accepted 18 June 2011）