超濾膜截留-二氧化鈦選擇性富集-納升級液相色譜-串聯質譜法檢測血清中內源性磷酸化肽

摘 要 采用超濾膜（Ultrafiltration membrane）去除血清中的大量高豐度蛋白、DNA和RNA等大分子量干擾化合物，然后利用TiO2富集超濾膜濾過液中的磷酸化肽，結合納升級超高壓液相色譜四極桿飛行時間質譜（nano UPLCQTOF）分離和檢測技術，提高了內源性磷酸化肽的檢測靈敏度；將本方法應用于肺癌患者血清中的內源性磷酸化肽分析，成功檢測到18種內源性磷酸化肽。本方法實現了高靈敏度、高選擇性血清中內源性磷酸化肽的富集和檢測，為腫瘤生物標志物的發現奠定了方法學基礎。

關鍵詞 超濾膜；TiO2富集；內源性磷酸化肽；nano UPLCQTOF

1 引 言

蛋白質磷酸化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾（Post translational modifications， PTMs），參與并調控著生命活動的幾乎所有過程，包括細胞增殖、分化，神經活動和新陳代謝等[1，2]。異常的蛋白質磷酸化是人類疾病發生的根本原因之一[3]。所以建立高靈敏度和高通量的磷酸化蛋白檢測方法，對于進一步理解生命進程、發現與疾病相關的生物標志物具有重要意義。目前，由于生物樣品中磷酸化肽的含量低，并且在質譜檢測中大量的非磷酸化肽段嚴重抑制磷酸化肽的離子信號[4，5]， 導致對磷酸化蛋白的鑒定具有挑戰性。因此在質譜分析前高選擇性地富集磷酸化肽非常重要[6，7]。固定金屬離子親和色譜（IMAC）[8]， 如Ga3＋IMAC和Fe3＋IMAC和金屬氧化物親和色譜（MOAC）[9]，如TiO2和ZrO2等，因其對磷酸化肽的高選擇性被廣泛應用于磷酸化蛋白組學研究中。

血清中含有來源于幾乎所有細胞、組織的蛋白及代謝產物，能夠直接反映機體的生理、病理狀況，為各種疾病研究提供最有價值的信息[10]。但由于血清成分極其復雜，同時具有很寬的動態范圍，使得血清中內源性磷酸化肽的檢測面臨很大的困難，相關報道很少。Hu等[11]利用一種基于有序介孔材料的固定化鈦離子親和色譜（Ti4＋IMAC）材料直接從人血清中富集并檢測到4種內源性磷酸化肽。本研究組[12]利用ZrO2包覆介孔氧化硅材料直接從人血清中富集到12種內源性磷酸化肽。以上兩種方法都是利用磷酸化肽中的磷酸根與富集材料中的金屬元素相互作用實現了磷酸化肽的選擇性富集。但是血清樣品中含有大量的脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）及磷酸化蛋白等大分子化合物，這些化合物都含有磷酸根，特別是RNA和DNA， 它們可能在上樣過程中與低豐度的磷酸化肽競爭富集材料上的作用位點，從而降低了血清中磷酸化肽的富集選擇性。因此，如何有效去除這些大分子量的干擾化合物，提高血清中低豐度磷酸化肽富集檢測方法至關重要。

本研究采用超濾膜（Ultrafiltration membrane）去除血清中的大量高豐度蛋白、DNA和RNA等大分子量干擾化合物，減少了在上樣過程中與磷酸化肽競爭作用位點的干擾物，提高了TiO2富集磷酸化肽的選擇性，結合納升級超高壓液相色譜四極桿飛行時間質譜（nano UPLCQTOF）分離和檢測技術，從肺癌患者血清中共檢測到18種內源性磷酸化肽，明顯提高了內源性血清磷酸化肽的檢測靈敏度。

2 實驗部分

2.1 材料與試劑

GELoader槍頭 （德國Eppendorf公司）； C18AQ材料 （德國Sunchrom公司）；3 K、10 K超濾膜、TiO2材料 （日本GL Sciences 公司）；α酪蛋白、三氟乙酸 （TFA）、乳酸 （LA）、NH4HCO3 （美國 SigmαAldrich 公司）; 測序級胰蛋白酶 （美國Promega公司）; 乙腈 （CAN，德國Merck公司）；甲酸 （FA，比利時Acros公司）；超純水由MillQ制備 （美國Millipore公司）；10%氨水溶液 （瑞士Fluka公司）。

2.2 酶解

將1 mg標準品α酪蛋白溶解于1 mL 50 mmol/L NH4HCO3 （pH 8.0） 溶液中，蛋白與胰蛋白酶按照40∶1（質量比）充分混合。在37 ℃下酶解12 h后，加入終濃度為0.5%甲酸終止反應。酶解液分裝后，在－70 ℃冰箱保存備用。

2.3 標準品的超濾膜過濾

將不同劑量的α酪蛋白酶解液與50% CH3OH0.5% FA溶劑充分混勻，將混合液移至10 K和/或3 K超濾膜中，在高速臺式冷凍離心機 （美國Fisher公司） 上，以13000 r/min離心60 min。取出濾過液（通過超濾膜）并旋干，再溶于40

SymbolmA@ L 300 mmol/L LA/80% ACN/0.1 FA的溶液中，待測。

 分 析 化 學第39卷

第12期鄒麗娟等: 超濾膜截留二氧化鈦選擇性富集納升級液相色譜串聯質譜法檢測血清中內源性磷酸化肽 

2.4 磷酸化肽段富集與脫鹽

稱取1 mg TiO2放入50% ACN/0.1% FA（40

SymbolmA@ L）中，制成勻漿液，裝入GELoader槍頭中， 用惰性材料塞緊。裝好的微柱依次用40

SymbolmA@ L的 0.1% FA， 80% ACN/0.1% TFA， 40

SymbolmA@ L×2的300 mmol/L LA/80% ACN/0.1% FA的溶液沖洗，將樣品注入微柱中，依次用40

SymbolmA@ L×2的300 mmol/L LA/80% ACN/0.1% FA）， 40

SymbolmA@ L 80% ACN/0.1% TFA， 40

SymbolmA@ L H2O洗脫，最后用10

SymbolmA@ L×2的5% NH3#8226;H2O收集，并用甲酸調至pH 3。

稱取1 mg C18AQ材料裝柱（同上），將裝好的微柱依次用40

SymbolmA@ L ACN，40

SymbolmA@ L×2的50% ACN/0.1% FA溶液沖洗，再用40

SymbolmA@ L×2的0.1% FA溶液平衡微柱，將上述富集到的收集液上樣，再用40

SymbolmA@ L×2 的0.1% FA溶液脫鹽，最后用20

SymbolmA@ L×2的50%ACN/0.1%FA 溶液洗脫收集并旋干，再用10

SymbolmA@ L的50% ACN/0.1% FA溶解，利用QTOF MS進行檢測。

2.5 血清樣品制備及富集與脫鹽

血清樣品前處理：1 mL血清樣品加入3倍體積20℃冷丙酮，將兩種液體充分混勻，以15000 g離心15 min。取出上清液并旋干，再溶于3.5 mL的50% CH3OH/0.5% FA溶液中，將其移至10 kDa超濾膜，以13000 g離心60 min。取出濾過液并旋干，再溶40

SymbolmA@ L的300 mmol/L LA/80% ACN/0.1 FA溶液中。

血清中內源性磷酸化肽段富集與脫鹽過程同2.4節，其中脫鹽得到的收集液旋干再溶于10

SymbolmA@ L 0.1% FA溶液中。

2.6 質譜分析

標準品磷酸化肽的鑒定由全掃描質譜在nanoESI QTOF MS（美國Waters公司） 上進行：進樣流速：1 mL/min。正離子模式（ESI＋）；nanospray 電壓：2.0 kV，掃描范圍為500～2000 Da。人血清中內源性磷酸化肽的鑒定在nano UPLCQTOF 上進行：將待測液 （流速為15

SymbolmA@ L/min）上樣于Symmetry C18捕集柱（10 mm×180

SymbolmA@ m I.D.， 5

SymbolmA@ m，美國Waters公司），然后閥切換到BEH 130 C18分析柱（100 mm×100

SymbolmA@ m， 1.7

SymbolmA@ m，美國Waters公司） 上進行反相液相色譜分離。流動相A: 含有0.1% FA的水溶液; 流動相 B: 含有0.1% FA的乙腈溶液。流速：0.6

SymbolmA@ L /min，梯度條件：0 min，5% B; 5 min，12% B; 105 min，43% B; 106 min，95% B; 110 min，95% B; 114 min，5% B; 120 min，5% B。質譜檢測采用正離子survey模式，電壓為2.0 kV，數據采集范圍為：MS設置為m/z 500～2000；MS/MS設置為m/z 100～2000。數據使用Proteinlynx處理（美國Waters公司）。

3 結果與討論

3.1 超濾膜截留分子量選擇

血清樣品中的RNA、DNA及磷酸化蛋白等大分子化合物干擾了磷酸化肽的富集效率，采用超濾膜凈化血清樣品。首先對不同規格的超濾膜進行評價，以α酪蛋白酶解液為檢測對象，經10 kDa超濾膜過濾，將濾過液均分為兩份，一份直接經TiO2富集、質譜檢測；另一份移至3 kDa超濾膜過濾，將濾過液和濃縮液（截留在膜上）均收集、旋干，3份試液分別經TiO2富集、質譜檢測。10 kDa超濾膜的濾過液（圖1A）與3 kDa超濾膜的濃縮液（圖1B ）在肽的檢測數量及豐度方面無太大差別；但3 kDa超濾膜的濾過液中（圖1C ）僅能檢測到少數低信號強度的肽。這表明10 kDa超濾膜可以有效地將大分子物質截留在超濾膜進液側，而將小分子磷酸化肽集中在濾過液中，起到降低樣品復雜度的作用；而3 kDa超濾膜將10 kDa濾過液都截留在膜上，僅有少量小分子物質可以透過，未起到降低磷酸化肽檢測復雜度的作用。本研究選用10 kDa超濾膜。

[TS（]圖1 α酪蛋白酶解物經過不同超濾膜過濾得到（A）10 kDa的過濾液、（B）3 kDa的濃縮液和（C）3 kDa的濾過液，3份試液分別經TiO2富集后的質譜圖

Fig．1 Mass spectra of tryptic αcasein filtered with different ultrafiltration membranes of （A） 10 kDa filtrate， （B） 3 kDa retentate，（C） 3 kDa filtrate and then ．enriched with TiO2[TS）]

3.2 血清稀釋溶劑的選擇

血清樣品因粘度較大，需稀釋后才能用于超濾膜過濾。但超濾膜在使用過程中對常用溶劑的濃度有所限制，根據本實驗所用超濾膜的使用說明，配制了兩種溶劑（50% CH3OH/0.1% FA和10% ACN/0.1% FA），并比較了兩種溶劑對樣品的稀釋及溶解性能。添加有α酪蛋白酶解液的血清樣品經過兩種溶劑稀釋后，分別經過TiO2富集和質譜分析，結果見圖2。用50% CH3OH/0.1% FA為稀釋溶劑時（圖2A），磷酸化肽（以★標記）的選擇性高于10%ACN/0.1% FA為稀釋溶劑磷酸化肽的選擇性 （圖2B），50% CH3OH/0.1% FA為稀釋溶劑所得質譜圖中（圖2A）基本沒有非磷酸化肽的干擾；且50% CH3OH/0.1% FA為稀釋溶劑所得磷酸化肽的豐度明顯高于10% ACN/0.1% FA為稀釋溶劑所得磷酸化肽的豐度。因為50% CH3OH/0.1% FA在實驗中稀釋血清和溶解的磷酸化肽的性能好，使磷酸化肽的損失較小、選擇性較高，所以接本實驗選用的稀釋溶劑是50% CH3OH/0.1% FA。

[TS（]圖2 添加有α酪蛋白酶解物的血清樣品分別經過（A）50%CH3OH/0.1% FA和（B）10% ACN/0.1% FA稀釋后，再經TiO2富集后的質譜圖

Fig．2 Mass spectra of serum spiked with tryptic αcasein diluted with （A） 50%CH3OH/0.1% FA and （B） 10% ACN/0.1% formic acid (FA) and then enriched with TiO2

★：磷酸化肽（Phosphopeptides）\\.[TS）]

3.3 靈敏度檢測

對于復雜、未知的血清樣品，無法對其中的磷酸化肽直接進行檢測，為檢驗本方法是否能檢測到血清中的內源性磷酸化肽，確定其檢出限非常必要。在保證超濾膜過濾和TiO2富集過程不變的前提下，取5

SymbolmA@ L Serum和125

SymbolmA@ L 50% CH3OH/0.5% FA作為基質，分別加入160、80、20和8 pmol的α酪蛋白酶解液，將4種混合液分別按本方法進行富集檢測。結果顯示：當α酪蛋白酶解液為160 pmol時，磷酸化肽的選擇性及豐度都很高（圖3A）；隨著α酪蛋白酶解液量的降低，本方法對磷酸化肽的選擇性降低（圖3B和圖3C）。當α酪蛋白酶解液降低到20 pmol時（圖3C），741.2292（1＋）為譜圖的基峰，但標準品中所含的磷酸化肽仍都可以檢測到，如830.9491（2＋）， 733.3816（2＋）， 651.1996（3＋）和976.5459 （2＋） 等。繼續降低α酪蛋白酶解液（8 pmol）時，磷酸化肽檢測受到嚴重抑制，僅能檢測到830.9491 （2＋）和976.5459 （2＋） 兩個磷酸化肽，其豐度很低，但是信號和噪音的比值大于3（圖3D）。所以本實驗中磷酸化肽的檢出限為8 pmol α酪蛋白酶解液，即濃度為61.6 nmol/L的磷酸化肽。

3.4 血清中內源性磷酸化肽的富集和檢測

將本方法應用于肺癌患者血清中內源性磷酸化肽的富集和鑒定。從1 mL肺癌患者血清中共檢測到

18種內源性磷酸化肽（表1）。為進行對比，在其它前處理方法相同的前提下，血清樣品不經過超濾膜過濾而直接進行TiO2富集，經過LCMS分析后，在血清中未檢測到磷酸化肽。此結果表明，超濾膜過濾可以有效去除生物大分子化合物的干擾，進而提高了TiO2富集磷酸化肽的選擇性和靈敏度。成功驗證了本方法對復雜樣品（如血清）的處理及檢測的適用性及應用價值。

4 結 論

建立的超濾膜方法可以有效去除血清中大量的蛋白、RNA和DNA等大分子化合物，提高了TiO2對內源性磷酸化肽的富集選擇性和靈敏度，結合nano UPLCQTOF技術進行內源性磷酸化肽的分離檢測，從血清中檢測并鑒定到18種內源性磷酸化肽。此方法可為疾病生物標志物的鑒定提供方法學的參考。

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Selective Enrichment of Endogenous Serum Phosphopeptides

with Ultrafiltration Membrane InterceptTitanium Dioxide

Chromatography Coupled with Nano Ultra High Pressure

Liquid ChromatographyQuadrupoleTime of

Flight Mass Spectrometry



ZOU LiJuan2， LI Juan2， WAN HuiHui1， LI XiuLing1， LIANG XinMiao1



1（Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Dalian 116023）

2（The Second Affiliated Hospitals of Dalian Medical University， Dalian 116044）





Abstract A novel method coupled ultrafiltration membrane with TiO2 was developed to remove large amount highmolecular weight compounds and enrich endogenous phosphopeptides in serum. The enriched endogenous serum phosphopeptides were characterized by nano ultrahigh pressure liquid chromatographyquadrupoletime of flight MS （nano UPLCQTOF MS）. Up to 18 endogenous phosphopeptides could be successfully identified from the serum of lung cancer. The sensitivity and efficiency of serum phosphopeptides detection was improved by this established method， which might be contributed to novel tumor biomarker discovery. 

Keywords Ultrafiltration Membrane; Titanium dioxide; Enrichment; Endogenous serum phosphopeptides; Nano ultra high pressure liquid chromatographyquadrupoletime of flight mass spectrometry

（Received 23 May 2011; accepted 22 June 2011）