超高效液相色譜串聯質譜聯用法快速測定生物樣品中莽草毒素

摘 要 建立了超高效液相色譜三重四極桿質譜法檢測血漿、尿液、嘔吐物和藥材中八角屬植物有毒倍半萜內酯標志物莽草毒素的檢測方法。血漿樣品經多重機制雜質吸附萃取凈化柱萃取， 尿液樣品經硅藻土柱吸附叔丁基甲醚萃取、植物樣品經叔丁基甲醚液液萃取，以水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，在UPLC BEH C18柱上實現分離，采用負離子ESIMS/MS MRM方式檢測。一次進樣分析時間為5 min。 血漿和尿液中的平均加標回收率分別為92.6%～100.3%和101%～118%；相對標準偏差分別為3.8%～11%和6.4%～17% （n＝6）； 定量限（S/N＝10）分別 為2.0 和 1.0

SymbolmA@ g/L。本方法簡單、準確、靈敏，適合于莽草毒素中毒樣品的測定。

關鍵詞 超高效液相色譜串聯質譜； 莽草毒素； 血漿； 尿液；生物樣品

1 引 言

八角茴香為木蘭科植物八角茴香（Illicium verum hook. f.）的果實，有溫陽，散寒，理氣等功效，用于治療寒疝腹痛、腎虛腰痛、脘腹冷痛等病癥，民間常用作烹飪調料。由于同屬植物果實的形態相似，八角茴香有許多偽品，如紅茴香、莽草、野八角等，有的具有毒性，誤用會引起中毒[1，2]，特別是日本莽草（Illicium anisatum L.）毒性較大。同屬多種植物中曾分離出莽草毒素（Anisatin）、新莽草毒素（Neoanisatin）和偽莽草毒素（Pseudoanisatin）等倍半萜內酯類成分[3，4]，并證實莽草毒素為γ氨基丁酸受體非競爭性拮抗劑[5，6]，小鼠腹腔注射可引起驚厥、死亡，LD50為0.76 mg/kg體重[7]。飲用八角茴香茶引起的中毒事件在歐美國家也時有報道[8]。為了控制八角茴香品質和鑒別偽品，可采用熱解析氣質聯用法測定揮發油特征成分[9]， 采用熒光顯微鏡和掃描電鏡進行顯微結構鑒別[10]， 采用PCR技術分析核酸片段[11]， 采用薄層層析法對植物中黃酮類和酸性成分進行分析，結合液相色譜串聯質譜聯用法測定莽草毒素[12]。上述方法中，僅 LCMS/MS方法可對引起中毒的主要成分莽草毒素進行定量測定。本研究建立了UPLCMS/MS快速測定生物樣品中莽草毒素的檢測方法，并應用于實際樣品的測定，方法簡便、快速、準確和靈敏。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Aquity UPLCQuattro Premier XE超高效液相色譜串聯質譜儀，配電噴霧源，Masslynx 4.1工作站（美國Waters公司）；BRUKER AVANCE 500 MHz超導核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；MR32i大容量高速冷凍離心機（法國Jouan公司）；ULTRATURRAX T25 型勻質機（德國IKAWERKE公司）；R205旋轉蒸發儀（瑞士Burch公司）； 2510超聲波清洗機（美國Branson公司）；MS2旋渦混旋器（德國IKA公司）； NEVAP氮吹儀（12孔，美國Organomation公司）；TDZ5WS自動平衡離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；Gradient A10 MillQ 超純水器（法國Millipore公司）。

乙腈和甲醇 （HPLC級，德國Merck公司），叔丁基甲醚 （HPLC級，美國Tedia公司）。Cleanert MASB管（60 mg/1 mL）、Cleanert MASA管（60 mg/1 mL）、Cleanert 蛋白沉淀管（1 mL）和Cleanert SLE管（200 mg/3 mL）（天津博納艾杰爾科技公司）。八角茴香，紅茴香（市售）。

2.2 莽草毒素標準品制備

150 g紅茴香果實經石油醚脫脂、甲醇提取，濃縮提取物除去甲醇，殘渣溶于水，再用乙酸乙酯萃取，萃取物經硅膠柱多次層析，氯仿甲醇（97∶3， V/V）洗脫，得無色針晶（30 mg），

2.3 色譜和質譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm

SymboltB@ 2.1 mm

SymboltB@ 1.7

SymbolmA@ m）和VanGuard BEH C18保護柱（5 mm×2.1 mm

SymboltB@ 1.7

SymbolmA@ m）， 購于Waters公司；流動相A為甲醇，B為水，梯度洗脫： 0～3.0 min，10%～40% A；3.0～3.1 min，40%～95% A；3.1～4.0 min，95% A；4.0～5.0 min，10% A。流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃; 進樣體積10

SymbolmA@ L。

電噴霧離子源負離子多反應監測（MRM）模式。ESI毛細管電壓： －2.7 kV；離子源溫度：120 ℃；錐孔反吹氣流量： 50 L/h，脫溶劑溫度: 380 ℃; 脫溶劑氣流量: 500 L/h; 碰撞室氬氣壓力: 0.352 Pa; 錐孔電壓: 28 V; 母離子m/z 326.9，子離子為m/z 296.9（定性離子）和m/z 126.8 （定量離子），其碰撞能量分別為12和14 eV。運行開始時，色譜柱流出液經六通切換閥切換至廢液中，直到1.80 min；質譜開始采集數據，直到2.7 min結束， 同時六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

 分 析 化 學第39卷

第12期張秀堯等： 超高效液相色譜串聯質譜聯用法快速測定生物樣品中莽草毒素 

2.4 樣品前處理

2.4.1 血漿樣品 100

SymbolmA@ L血漿移入Cleanert MASB柱中，快速加入500

SymbolmA@ L乙腈甲醇 （9∶1， V/V） 混合液，旋渦15 s，靜置3 min以上，以3500 r/min離心5 min，流出液于50 ℃以氮氣吹干，加入50

SymbolmA@ L 10%甲醇，旋渦，待測。在6只MASB柱中各加入100

SymbolmA@ L空白血漿，再分別加入莽草毒素標準溶液濃度分別為2.0， 5.0， 10， 20， 50和100

SymbolmA@ g/L， 旋渦15 s，放置30 min后，與樣品一起處理，制作標準工作曲線。

2.4.2 尿液樣品 吸取200

SymbolmA@ L尿液加至Cleanert SLE柱中，靜置5 min以上，將2.1 mL叔丁基甲醚分3次加入，在重力作用下進行洗脫，洗脫液在50 ℃以氮氣吹干，加入100

SymbolmA@ L 10%甲醇復溶，待測。

在6只試管中分別加入適量標準溶液，在50 ℃以氮氣吹干，加入1.0 mL尿液，使莽草毒素的濃度分別為1.0， 2.0， 5.0， 10， 50和100

SymbolmA@ g/L，放置30 min后，與樣品一起處理，制作標準工作曲線。

2.4.3 嘔吐物 稱取1.00 g樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL甲醇，超聲提取10 min，10000 r/min離心5 min，吸取2.0 mL上清液于50 ℃以氮氣吹干，加入200

SymbolmA@ L水溶解殘渣（必要時用1 mL正己烷脫酯1次），吸取100

SymbolmA@ L水液加至MASB柱中，按2.4.1節操作。

2.4.4 八角茴香和紅茴香等偽品 稱取1.00 g樣品，按2.4.3節提取，取500

SymbolmA@ L上清液，于50 ℃以氮氣吹干，加入0.5 mL水溶解殘渣，用2 mL正己烷脫酯1次，再用各2 mL叔丁基甲醚萃取3次，合并萃取液，于50 ℃以氮氣吹干，加入500

SymbolmA@ L 10%甲醇，旋渦，過0.20

SymbolmA@ m濾膜后，待測。紅茴香提取液用10%甲醇適當稀釋，待測。紅茴香藥酒以氮氣吹去乙醇后，用10%甲醇稀釋，待測。

3 結果與討論

3.1 質譜和色譜條件的優化

分別在電噴霧正、負離子檢測方式下對質譜測定條件進行優化，使樣液中目標化合物的分子離子對信號達到最大，莽草毒素只能在電噴霧負離子模式下離子化，最終選擇ESI負離子MRM模式進行測定。遵循國際慣例，確證分析需要4個識別點，選擇兩對分子離子對，設定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數在15～20點，從而得到較好的定量重復性。 

比較UPLC BEH C18色譜柱（50 mm× 2.1 mm×1.7

SymbolmA@ m）和UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7

SymbolmA@ m） 發現，前者分離效果好，分析時間短。以水甲醇和水乙腈系統作為流動相，實驗表明，水甲醇作為流動相時，莽草毒素的離子化效率高，既有足夠的靈敏度，又能與其它成分完全分離、得到良好的峰型，一次進樣分析僅需5 min。

3.2 樣品前處理方法的選擇

植物果實中的莽草毒素的前處理可先用正己烷脫脂，除去揮發油等弱極性成分，再用甲醇提取。提取物的水液吸附在Extrelut柱（硅藻土柱）上，用叔丁基甲醚萃取凈化[13]。

血漿樣品分別通過MASA， MASB和蛋白沉淀柱。比較發現，MASB柱去除蛋白和磷酯等雜質效果最好，基質效應最小；尿液樣品采用SLE柱吸附叔丁基甲醚萃取可去除尿中基質成分，凈化效果明顯。本方法取樣量小、操作方便、快速（每小時可處理15份樣品）、回收率好。血漿樣品如果只用乙腈作沉淀萃取劑，血漿蛋白沉淀時易抱團，可能會包裹待測物。在乙腈中加入10%甲醇，沉淀成絮狀，待測物易于溶出提取。采用離心洗脫，樣品能成批快速處理。

3.3 基質效應和樣品的個體差異性

采用本方法樣品前處理與溶劑標準相比較，血漿和尿液樣品還存在基質增強效應，約增強20%，嘗試采用陰性樣品基質匹配法克服基質增強效應。由于個體差異，不同來源的血漿和尿液樣品可能存在不同的基質效應，最終影響檢測方法的準確度和精密度。本研究對不同來源樣品引起的基質效應進行評估，分別使用6種不同個體的空白血漿和空白尿液制作標準工作曲線；6條的斜率相對標準偏差分別為8.6%（血漿）和4.8%（尿液），符合FDA生物分析方法確證指導原則關于斜率的RSD應小于15%的要求[15]，說明樣品的個體差異對結果的影響較小，可以采用基質匹配法有效抵消基質增強作用。

紅茴香等樣品中莽草毒素的含量較高，甲醇提取后再用流動相高倍稀釋，可以克服基質效應。八角茴香及其制品中莽草毒素的含量較低，其甲醇提取物的水溶液經正己烷萃取除去揮發油等弱極性成分后，用叔丁基甲醚萃取3次，回收率大于90%，去除了雜質，消除了基質效應。

3.4 方法的線性范圍和檢出限

在空白樣品中，加入系列濃度的標準溶液，制作6點系列基質標準溶液，進行樣品前處理。在選定的色譜和質譜條件下測定，莽草毒素的保留時間為2.34 min，基質空白均無干擾。采用Masslynx 4.1中Targetlynx組件，以定量離子對的峰面積對濃度進行回歸（權重取1/x），血漿和尿液中莽草毒素在2.0～100

SymbolmA@ g/L和1.0～100

SymbolmA@ g/L濃度范圍的相關系數分別在0.9959～0.9990和0.9939～0.9996之間。

在空白樣品中添加系列低濃度的標準溶液，樣品經前處理，然后測定。以定量離子對3倍信噪比的響應值對應的樣品濃度為檢出限（LOD），以10倍信噪比為定量限（LOQ）。血漿和尿液中莽草毒素的檢出限均為0.5

SymbolmA@ g/L，定量限分別為2.0和1.0

SymbolmA@ g/L，能夠滿足公共衛生突發事件和臨床毒物學檢測的要求。

3.5 方法的精密度和加標回收實驗

空白血漿樣品添加2.0， 10和50

SymbolmA@ g/L的莽草毒素，空白尿液添加1.0， 10和50

SymbolmA@ g/L的莽草毒素，進行加標回收和精密度實驗，血漿和尿液的加標回收率分別為92.6%～100.3%和101%～118%，相對標準偏差分別為3.8%～11%和6.4%～17%（n＝6），符合痕量分析的要求。

3.6 樣品的穩定性實驗

分別用空白血漿、尿液加標溶液配制成含10

SymbolmA@ g/L莽草毒素的質控樣品，進行3次冷凍和解凍循環（－20 ℃至室溫），與新制備的樣品進行測定比較，相對偏差的絕對值均小于8%；將含10

SymbolmA@ g/L莽草毒素的血漿和尿液質控樣品的處理液置于自動進樣瓶中，在樣品室中放置24 h，與新處理的樣品進行比較測定，相對偏差的絕對值均小于7%，表明在上述條件下樣品未發生明顯分解。

3.7 實際樣品的檢測

2010年4月，溫州市泰順縣曾發生一起誤飲山木蟹（紅茴香植物的根）藥酒引起3人中毒事件，利用本方法從藥酒中檢出莽草毒素，其含量為113 mg/L。對市售1份紅茴香、2份八角茴香和1份五香粉進行檢測，莽草毒素的含量分別為645000， 191， 92和18

SymbolmA@ g/kg，與文獻[13]一致。



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Rapid Determination of Anisatin in Biological Sample by Ultra Performance

Liquid ChromatographyTriple Quadrupole Mass Spectrometry

ZHANG XiuYao*， CAI XinXin



（Wenzhou Center for Disease Control and Prevention， Wenzhou 325001）



Abstract A rapid UPLCMS/MS method was developed for the quantitative determination of anisatin， as a marker of the sesquiterpene lactones in various Illicium species， in plasma， urine， vomit， and plant samples using a triple quadrupolep mass spectrometer. The proposed assay includes multifunction impurity adsorption SPE cleanup procedure for plasma sample， diatomite solid supported liquid/liquid extraction for urine， and tertbutyl methyl ether liquid/liquid extraction for plant sample. The satisfactory recoveries were obtained. Chromatographic separation was performed on an UPLC BEH C18 column （50 mm

SymboltB@ 2.1 mm

SymboltB@ 1.7

SymbolmA@ m） using gradient elution with watermethanol， and detected by the negative electrospray ionizationMS/MS method under multiple reaction monitor mode. The cycle time of each analysis was 5.0 min. The average recoveries were 92.6%－100.3% and 101%－118% with RSDs of 3.8%－11% and 6.4%－17% （n＝6） for anisatin in plasma and urine， respectively. The limits of quantitation （S/N＝10） were 2

SymbolmA@ g/L and 1

SymbolmA@ g/L for plasma and urine sample， respectively. The method is simple， selective and sensitive to the determination of anisatin in biological sample for toxicological purposes．

Keywords Ultraperformance liquid chromatographytandem mass spectrometry; Anisatin; Plasma; Urine; Biological sample

（Received 31 March 2011; accepted 28 June 2011）