替代模板法制備甲硝唑分子印跡聚合物及其在血清樣品固相萃取中的應(yīng)用

摘 要 [HTSS]以甲硝唑酯化物（MNZEs）為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，氯仿為致孔劑，合成了對(duì)甲硝唑（MNZ）具有特異吸附性能的分子印跡聚合物（MIP）。由靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，印跡指數(shù)為2.02，說明MIP對(duì)MNZ具有良好的識(shí)別性能。MIP吸附屬于Langmuir 吸附模型，其對(duì)MNZ的吸附屬于單層分子吸附，其最大表觀吸附量Qmax為116

SymbolmA@ mol/g，結(jié)合常數(shù)K為0.65 L/mmol。在固相萃取實(shí)驗(yàn)中，MNZ在分子印跡固相萃?。∕ISPE）和非印跡固相萃?。∟ISPE）上的回收率分別為97.4%和44.3%，而結(jié)構(gòu)類似物MNZEs和對(duì)硝基苯酚在印跡和非印跡柱子上的回收率均小于11.6%，表明替代模板MIP對(duì)MNZ具有很高的選擇性吸附。應(yīng)用MISPE分離富集血清樣品中的MNZ回收率為94.5%，說明替代模板MIP可實(shí)現(xiàn)血清樣品中MNZ的選擇性分離富集，且沒有模板滲漏。

關(guān)鍵詞 [HTSS]甲硝唑; 替代模板; 分子印跡聚合物; 固相萃取

1 引 言

甲硝唑（MNZ）是臨床常用的硝基咪唑類抗微生物藥物，可抑制阿米巴原蟲氧化還原反應(yīng)，使原蟲氮鏈發(fā)生斷裂，具有抗菌和消炎的作用[1]。在環(huán)境和生物樣品中，檢測MNZ的方法有氣相色譜法[2]、高效液相色譜法[3～6]、質(zhì)譜法[7]和分光光度法[8]等。

溶劑萃取和固相萃取法（Solid phase extraction，SPE）是提取生物樣品中MNZ的有效前處理手段[9]。但傳統(tǒng)的SPE吸附劑和被分析物之間的作用力是非特異性的，吸附率和回收率均不佳。與之相比，分子印跡聚合物（MIP）具有高選擇性、親和性及預(yù)定性，故MIP作為SPE材料得到了廣泛應(yīng)用。Mohamed等[10]制備了硝基咪唑類化合物的MIP，但并未給出功能單體等重要因素。Jafari等[11]將MNZ作為模板分子制備MIP，其回收率僅89%，也未考察聚合物的印跡效果。但MISPE應(yīng)用中有模板分子滲漏的缺陷，會(huì)干擾目標(biāo)物測定。為解決模板滲漏，Matsui等[9]提出了替代模板法。該法是將目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)類似物作為模板分子，制備對(duì)目標(biāo)分子有選擇性MIP的一種新方法。已對(duì)多種化合物使用替代模板法制備了MIP，基本解決了模板滲漏問題[12～16]。

本研究采用替代模板法制備MNZMIP，將其作為SPE吸附劑，考察聚合物的吸附量和選擇性，并應(yīng)用于生物樣品的分離與富集。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑



ProStar高效液相色譜分析儀（美國VARIAN公司）； UV2450紫外可見分光光度計(jì) （日本島津公司）；5S1020固相萃取儀（北京振翔工貿(mào)有限公司）。甲硝唑 （MNZ，杭州大陽化工有限公司）；甲基丙烯酸 （MAA，純度＞99.5%，AcrosOrganics公司）；對(duì)硝基苯酚（4NP，杭州大陽化工有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（用前除阻聚劑，EDMA，分析純，百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）；偶氮二乙丁腈（用甲醇重結(jié)晶，AIBN，化學(xué)純，上海試劑廠）；甲醇（MeOH，色譜純，TEDIA，New Jersey），其它試劑均為分析純。

2.2 替代模板的合成

將3.0 mL （32 mmol） 乙酸酐滴入1.0 g （5.84 mmol） MNZ中，水浴加熱至70 ℃，攪拌反應(yīng)4 h，減壓蒸干[17]。剩余物經(jīng)柱色譜分離，得0.9348 g 金黃色晶體（MNZEs），熔點(diǎn)為75～76 ℃，產(chǎn)率為75%。1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ＝7.96 （s， 1H）， 4.58 （m， 2H）， 4.41 （m， 2H）， 2.51 （s， 3H）， 2.03 （s， 3H）。

2.3 MIP的制備

將0.1704 g （0.8 mmol）MNZEs、0.3444 g （4 mmol）MAA、40 mg AIBN、3.1715g （16 mmol）EDMA，5.5 mL氯仿，置于聚合瓶中，充分溶解混勻，超聲脫氣5 min，通氮?dú)?0 min，密封。將聚合瓶放入50 ℃恒溫油浴鍋中加熱24 h，得到白色塊狀聚合物。將塊狀聚合物用濕法研磨，過篩收集得到粒徑38～75

SymbolmA@ m的微粒，以冰乙酸甲醇（1∶9， V/V）溶液洗至無MNZEs檢出；再用甲醇洗去乙酸，最后真空干燥至恒重。NMIP的制備：除不加入MNZEs外，其余步驟與MIP的制備過程相同。

2.4 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

稱取20 mg MIP（或NIP），置于5 mL容量瓶中，加入4 mL MNZ二氯甲烷溶液（10～350 mg/L），室溫振蕩12 h。溶液經(jīng)微孔膜過濾，濾液用二氯甲烷適當(dāng)稀釋，測317 nm處的吸光度，計(jì)算MNZ的回收率。

2.5 分子印跡固相萃取（MISPE）

稱取100 mg干燥的MIP（或NIP），置入1 mL SPE 小柱中，在聚合物上放置塞板。小柱分別用2 mL甲醇和2 mL二氯甲烷活化，MNZ二氯甲烷溶液上樣1 mL，依次用1 mL二氯甲烷和1 mL乙腈二氯甲烷（5∶95， V/V）淋洗，1 mL甲醇洗脫兩次，以吸光度計(jì)算回收率。

2.6 樣品的制備及萃取

取空白牛血清樣品0.4 mL，置于具塞離心管中，準(zhǔn)確加入0.1 mL 450 mg/L MNZ水溶液，渦旋混勻1 min；加3 mL氯仿異丙醇 （95∶5， V/V）混勻，2000 r/min離心10 min，除去蛋白質(zhì)；準(zhǔn)確量取上層清液2.5 mL，在40 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈?，?.0 mL二氯甲烷溶解，按照2.5節(jié)的方法進(jìn)行固相萃取。萃取液用HPLC法測定，色譜柱為依利特C18分析柱（150 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m），流動(dòng)相為甲醇水（15∶85，V/V）；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20

SymbolmA@ L；柱溫為25 ℃；檢測波長315 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 替代模板分子與功能單體的相互作用



MNZ是一種水溶性藥物，在常用的制備MIP的溶劑（氯仿、乙腈、甲苯）中溶解性差。因此，用自制的MNZ酯化物作為替代模板法制備對(duì)MNZ具有特異吸附性能的MIP，在Silicon Graphics Octane running IRIX 6.5操作系統(tǒng)上，采用SYBYL 6.9TM軟件的LEAPFROGTM算法進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬[17，18]。模擬結(jié)果顯示， MAA分子中的OH替代模板分子， MNZEs，中的CO有強(qiáng)氫鍵作用（圖1），并形成穩(wěn)定的復(fù)合物。以EDMA為交聯(lián)劑，氯仿為致孔劑，AIBN為引發(fā)劑時(shí)，能在復(fù)合物周圍形成固定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的MIP，對(duì)MNZ有很強(qiáng)的特異吸附性能。

3.2 MIP的結(jié)合能力和印跡指數(shù)

除去模板分子后，在MIP中形成與模板分子在空間和結(jié)合位點(diǎn)上相匹配的具有多重作用位點(diǎn)的空穴，這樣的空穴對(duì)模板分子具有很高的選擇性[19]。通過吸附前后溶液中MNZ含量變化，計(jì)算MIP（或NIP）對(duì)MNZ的結(jié)合量（Q）：Q＝（C0－C）V/m （C0和C分別是吸附前后溶液中MNZ的濃度（mg/L），V是溶液的體積，m是MIP（或NIP）的質(zhì)量。[TS（][HT5”SS]圖1 替代模板分子MNZEs與功能單體MAA的結(jié)構(gòu)式及其計(jì)算機(jī)模擬

Fig．1 Chemical structures of dummy template metronidazole ester （MNZEs）， monomer methacrylic acid （MAA） and results of computer modelling[TS）]

由圖2可見，隨著濃度的提高，MIP和NIP的吸附量隨之增大；濃度為1.46 mmol/L時(shí)，吸附達(dá)到飽和。此時(shí)MIIPs和NIP對(duì)MNZ的吸附容量分別為34.0和16.8

SymbolmA@ mol/g，印跡指數(shù)為2.02，表明MIP對(duì)MNZ具有良好的選擇性吸附能力。

[TS（][HT5”SS] 圖2 MIP和NIP的吸附等溫曲線

Fig．2 Adsorption isotherms of MIP and nonmolecularly imprinted polymer （NIP）[TS）]

以Langmuir等溫吸附模型[20]， 1/Q ＝1/QmaxKC ＋1/Qmax （Qmax為結(jié)合位點(diǎn)的最大表觀吸附量，K為結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)）， 擬合圖2中的MIP吸附曲線。經(jīng)1/Q對(duì)1/C線性回歸，得方程y＝0.0133x＋0.0086，R2＝0.998，與Langmuir等溫吸附模型吻合很好。說明在所研究的濃度范圍內(nèi)，MNZ在MIP上的吸附是單層分子吸附。通過曲線截距計(jì)算最大表觀吸附量Qmax為116

SymbolmA@ mol/g，由截距和斜率之比計(jì)算結(jié)合常數(shù)K為0.65 L/mmol。

3.3 固相萃取（SPE）條件的優(yōu)化

分別用水、甲醇、乙腈、氯仿和二氯甲烷作為溶劑，考察MISPE和NISPE對(duì)MNZ的保留能力。由圖3可見，在水中回收率最低（NIP 和 MIP的分別為12.1%和16.4%），而二氯甲烷中回收率最高（NIP和MIP的分別為86.2%和98.3%），即回收率隨溶劑極性降低而升高，故選二氯甲烷為上樣溶劑。 

目標(biāo)分子在MIP表面上的結(jié)合形式并非是完全的特異性吸附，選用合適的淋洗劑，可減少非特異性吸附。由圖4可見，用1 mL甲醇或乙腈時(shí)，不但能淋洗MISPE上非特異性吸附的MNZ，同時(shí)特異性吸附的MNZ也被林洗掉，回收率分別是6.3%和14.5%。二氯甲烷作為淋洗劑時(shí)，MIP的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣谛纬蓺滏I的狀態(tài)，MNZ被選擇性地保留在MIP上，而其它雜質(zhì)物都被淋洗劑除去。為了獲得高選擇性，將少量的乙腈加入到二氯甲烷中，作為淋洗劑，除去樣品中非特異性吸附的殘留物。當(dāng)乙腈含量為5%時(shí)，MNZ在NISPE上的回收率較低（77.5%），而在MISPE上很高（97.9%）。

因此，選定1 mL二氯甲烷和1 mL 5%（V/V）乙腈二氯甲烷作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的淋洗溶劑。極性強(qiáng)的溶劑能有效破壞MIP和

[TS（5*2][HT5”SS] 圖3 不同溶劑中MNZ（50 mg/L）在MIP和NIP上回收率

Fig．3 MIP and NIP recoveries （%） for 1 mL 50 mg/L of metronidazole in different loading solvents

[TS）]

[TS（5*2][HT5”SS] 圖4 用不同淋洗溶劑時(shí)MNZ在MISPE 和 NISPE上回收率

Fig．4 Effect of washing solvents on recoveries of MNZ on molecularl imprintedsolid phase extraction (MISPE) and NISPE[TS）]目標(biāo)分子之間的特異性結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)使用甲醇為洗脫液時(shí)回收率最高。因此，選擇2×1.0 mL甲醇為洗脫液。

3.4 MIP的選擇性實(shí)驗(yàn)

為評(píng)價(jià)替代模板MIP的選擇性，以MNZEs和4NP作為結(jié)構(gòu)類似物，研究它們?cè)贛ISPE（或NISPE）上的保留能力。由圖5可見，MNZ在MISPE和NISPE上的回收率分別為97.4%和44.3%，說明MIP對(duì)MNZ有很高的吸附選擇性。然而，MNZEs和4NP在MISPE上的保留能力很差，回收率分別為11.6%和4.3%，它們?cè)贜ISPE上的回收率分別為5.6%和5.2%。這些化合物在MIP上的吸附主要是非特異性吸附，所以都能被大量淋洗除去。

作為結(jié)構(gòu)類似物的MNZEs，具有與MNZ相同的分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，它的回收率略高于4NP。雖然4NP分子中也有能形成氫鍵的官能團(tuán)（硝基，羥基），但它的形狀和大小與MIP中的空穴相差很大，很難與識(shí)別位點(diǎn)發(fā)生作用。MIP在選擇性吸附過程中，目標(biāo)分子的獨(dú)特形狀和特有功能基團(tuán)同時(shí)起關(guān)鍵作用。

[TS（][HT5”SS]圖5 50 mg/L MNZ， MNZester， 4NP二氯甲烷溶液在MISPE和NISPE上的萃取分離

Fig．5 Extraction profiles obtained with MISPE and NISPE after percolation of dichloromethane spiked with MNZ， MNZester， 4NP at 50 mg/L （n＝4， RSD＝1.5%～7%）[TS）]

3.5 血清樣品的測定

在上述條件下，用替代模板分子印跡固相萃取對(duì)血清樣品的MNZ進(jìn)行分離富集。血清樣品是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，其中的一些蛋白質(zhì)會(huì)影響測試結(jié)果，本研究采用氯仿/異丙醇分離血清中的蛋白

[FQ（８２\\.22，Y－ＷＺ][HT5”SS][HJ*4]表1 MISPE凈化牛血清中MNZ后HPLC分析結(jié)果

Table 1 Results from HPLC analysis of MISPEpurified extracts of MNZspiked calf serum

質(zhì)。按照MNZ在人體中有效血藥濃度（1.0～5.0 mg/L），選取3個(gè)濃度配制血清樣品，去除蛋白質(zhì)后用MISPE處理，用HPLC平行測定4次，結(jié)果見表1。MNZ分析柱的保留時(shí)間為4.98 min，方法的檢出限為0.2 mg/L?？梢?，替代模板MISPE對(duì)血清藥品中的MNZ較高的萃取回收率（平均值為94.5%），具有一定應(yīng)用價(jià)值。

本研究以自制的甲硝唑酯化物（MNZEs）為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，氯仿為致孔劑，合成了高度選擇性的替代模板MISPE，實(shí)現(xiàn)了血清樣品中的MNZ分離富集和檢測，解決了模板滲漏。

致 謝 Crandield University的Elena V. Piletska在計(jì)算機(jī)模擬方面給予的幫助

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Dummytemplate Molecularly Imprinted Polymer for Selective Solid Phase

Extraction of Metronidazole in Bovine Serum

TURGHUN Muhammad*， ABDUKIREM Kadier， HALIDAN Mamat， NILUPAER Abudukeyoumu



（Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemicals， Ministry of Education and Xinjiang Uyghur Autonomous Region，

College of Chemistry and Chemical Engineering， Xinjiang University， Urumqi 830046）





Abstract Metronidazole （MNZ） ester was chosen as a dummy template， methacrylic acid as monomer， ethylene glycol dimethacrylate as crosslinker and chloroform as porogen to synthesize dummytemplate molecularly imprinted polymers （MIP） for MNZ. The result of batch rebinding tests showed that imprinting factor of the polymer was 2.02， indicating high recognition ability of the MIP against MNZ. MIP adsorption isotherm was fit to Langmuir adsorption model， therefore it was monolayer adsorption， with maximum binding capacity Qmax of 116

SymbolmA@ mol/g and binding constant K of 0.65 L/mmol. The recoveries of MNZ on MIP and nonimprinted cartridges were 97.4% and 44.3% respectively in solid phase extraction （SPE） experiment. However， the analogues of MNZ， MNZ ester and 4nitrophenol， had recoveries less than 11.6% on both MIP and NIP in SPE， showing the high selectivity of the dummy template MIP against MNZ. The MIP was successfully used for the separation and concentration of MNZ spiked serum sample with mean recovery of 94.5%， which demonstrated that MIP was feasible of pretreatment of MNZ serum sample without template bleeding.

Keywords Metronidazole; Dummytemplate; Molecularly imprinted polymer; Solid phase extraction

（Received 14 April 2011; accepted 6 August 2011）