納米金顆粒/麥爾多拉藍溶膠的合成及NADH傳感器應用

1 引 言

脫氫酶是氧化還原酶中為數(shù)最多的一類酶，目前已知超過300種脫氫酶使用氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作為輔酶。在這些酶和輔酶協(xié)同作用催化底物時，NAD+從底物接受電子被還原成還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。建立高靈敏度的方法檢測NAD+的還原形式NADH，在生物過程分析和酶分析過程中具有重要意義[1，2]。但是，在中性條件下，NADH在裸電極上的直接氧化通常有較大的過電位。通常氧化還原媒介體（如甲苯胺蘭[3]，亞甲基藍[4]和麥爾多拉藍（MDB）[5]）多作為電催化劑，催化NADH氧化。

金納米粒子（AuNPs）與電極間形成的導電性通道能顯著提高電極界面的電子轉(zhuǎn)移速率。采用AuNPs修飾電極加速界面電子轉(zhuǎn)移動力，降低NADH氧化的過電位的研究多有報道[2，6～8]。如果能夠?qū)uNPs的導電性和電催化性質(zhì)與氧化還原媒介體結(jié)合，協(xié)同的電催化效應能夠明顯降低過電位，并提高穩(wěn)定性。本研究建立了簡單制備新型AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶膠的方法。陽離子交換樹脂Eastman AQ55D通過離子交換作用固定陽離子媒介體MDB，同時作為AuNPs的保護劑和穩(wěn)定劑。制備的AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶膠直接滴涂到玻碳（GC）電極表面，作為NADH的傳感器，顯著降低了NADH的氧化電位，顯現(xiàn)了較高的電催化活性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑 JEOL 2010 TEM儀（日本電子株式會社），加速電壓為200 kV。CHI660B 電化學儀（美國CH公司）和CHI832型電化學儀（上海辰華公司）。Eastman AQ55D陽離子交換樹脂（Sigma公司）。吩噻嗪衍生物MDB，NADH，氯金酸和檸檬酸鈉等試劑均為分析純，實驗所用水經(jīng)Millipore MilliQ 純化。磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.0）。PBS的離子強度通過改變磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉的濃度（0.01， 0.05， 0.10和0.50 mol/L）調(diào)節(jié)。玻碳電極為工作電極，旋狀鉑絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極。在實驗前，通入高純氮氣至少30 min，得到氮氣的飽和溶液。

2.2 AuNPs/Eastman AQ55D/MDB/GC修飾電極的制備 制備AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶膠：將20

SymbolmA@ L分散度為28%的Eastman AQ55D（AQ）加水稀釋至5 mL后，邊攪拌邊加入10

SymbolmA@ L 0.01 mol/L MDB，100

SymbolmA@ L 0.01mol/L氯金酸，及足量1% NaBH4。AuNPs/AQ溶膠的制備與AuNPs/AQ/MDB基本相同，僅未在混合液中加入MDB。將玻碳電極用Al2O3粉拋光至鏡面，經(jīng)水沖洗，再依次用乙醇和水超聲清洗。將5

SymbolmA@ L AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶膠滴加到處理好的玻碳電極表面，在4 ℃下干燥。

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3 結(jié)果與討論

3.1 形貌表征 向陽離子交換樹脂（AQ）/MDB混合液中加入氯金酸和還原劑NaBH4，溶液的顏色逐漸變成紫紅色，形成AuNPs。AuNPs分散性較好，尺寸約5 nm。在兩個對照實驗中，（1）溶液中加入MDB和氯金酸，未加入聚合物AQ，帶正電荷的MDB與帶負電荷的氯金酸離子由于靜電作用而形成沉淀；（2）溶液中加入AQ 和氯金酸，未加入MDB，氯金酸在硼氫化鈉的還原作用下仍可形成金納米粒子溶膠。結(jié)果表明，陽離子交換樹脂AQ也可作為金納米粒子的分散劑。AuNPs/Eastman AQ55D/MDB溶膠放置數(shù)月未生成沉淀，表明用AQ作為AuNPs分散劑制備的溶膠穩(wěn)定性很好。

3.2 修飾電極的電化學性質(zhì) 該復合膜修飾電極在PBS （pH 7.0）中的循環(huán)伏安圖處在－0.15 V出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰，對應MDB的氧化還原[5]。此修飾電極在所有的掃速范圍內(nèi)呈現(xiàn)了可逆的表面氧化還原電化學（峰峰電位差很小）。實驗表明， 其氧化電流和還原電流分別與掃描速度呈現(xiàn)良好的線性關系，其電位幾乎與掃描速度無關，在所有的掃描速度范圍內(nèi)氧化峰電流與還原峰電流的比率始終沒有變化，說明AuNPs/Eastman AQ55D/MDB復合膜中MDB的電化學行為是快速的表面控制的電子傳遞過程。在－0.5～0.1 V范圍內(nèi)連續(xù)掃描1 h，此修飾電極的穩(wěn)定性較好。

3.3 修飾電極對NADH氧化的電催化活性 AuNPs/AQ/GC修飾電極上NADH電化學氧化峰約為200 mV（圖1C）。AQ/MDB/GC電極對NADH的電化學氧化峰約為－50 mV（圖1B）。AuNPs/Eastman AQ55D/MDB/GC修飾電極的NADH氧化峰電位與圖1B相比略有降低，但是差別不大，電流明顯增加（圖1A）。以上結(jié)果表明：AuNPs和MDB之間存在協(xié)同電催化效應，加入電子導體AuNPs，加快了MDB媒介的NADH氧化反應，引起了MDB氧化還原行為的增強，這可能是由于溶膠中摻雜的AuNPs具有較大的比表面積，使其在玻碳電極上形成的復合膜能夠更快的進行物質(zhì)擴散。AuNPs還具有較好的電導性和電催化性，可作為復合膜中MDB與電極之間的“橋梁”，從而加速了膜中的電荷傳遞，降低NADH在電極表面氧化過程的過電位。

[TS（][HT6SS]圖1 AuNPs/Eastman AQ55D/MDB/GC修飾電極 （A），AQ/MDB/GC修飾電極（B）和AuNPs/AQ/GC修飾電極（C）電催化氧化NADH的循環(huán)伏安圖（氮飽和PBS（pH 7.0），掃速200 mV/s）。a，b線分別是加入NADH前后的循環(huán)伏安圖

Fig．1 Cyclic voltammograms of AuNPs/Eastman AQ55D（AQ）/Meldola′s blue （MDB）/GC electrode （A）， AQ/MDB/GC electrode （B） and AuNPs/AQ/GC electrode （C） in N2saturated PBS （pH 7.0）with scanning rate 200 mV/s: Curves a is in absence of NADH while curve b is in presence of NADH[HT5”SS][TS）]

本修飾電極對連續(xù)加入NADH響應的典型計時電流響應結(jié)果表明：NADH的檢測線性范圍為0.1～1.1 mmol/L，靈敏度為70 mA/（mol/L），檢出限為0.02 mmol/L。在含有1.0 mmol/L NADH的PBS中連續(xù)掃描30 min后，相應的電化學信號基本保持不變。采用相同條件下制備的6支電極對1.0 mmol/L NADH進行檢測，電化學信號的相對標準偏差為4.8%。將修飾電極貯存于4 ℃冰箱內(nèi)，每天取出進行測量，30 d后，電化學信號仍然可以保持92.3%。

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Synthesis and Application Gold Nanopaticles/Meldola′s

Blue Colloids as NADH Biosensors

ZHANG XiaoHong1，CHEN LiBo2，WEI ZhongHang2

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1（School of Pharmaceutical Sciences， Jilin University， Changchun 130021）

2（ChinaJapan Union Hospital of Jilin University， Changchun 130033）

Abstract This study reports a method for facile synthesis of gold nanoparticles/Eastman AQ55D/meldola′s blue （AuNPs/Eastman AQ55D/MDB） colloids. Cation exchange resin Eastman AQ55D can not only immobilize the redox mediator MDB by ion exchange interaction， but also serve as the protectant and stabilizer of AuNPs. Due to remarkable synergistic effect of AuNPs and MDB， the electrode modified with the AuNPs/Eastman AQ55D/MDB colloids apparently reduced the activation energy of Nico tina mideadenine dinucleotide （NADH） oxidation in the electrode surface. Chronoamperometry on NADH biosensor showed that the linear range for fast detection of NADH was 0.1 to 1.1 mmol/L and the sensitivity was 70 mA/（mol/L）. Facile synthesis of AuNPs/Eastman AQ55D/MDB composite films with high stability， high sensitivity and high reproducibility is promising for the reliable and durable NADH biosensors. 

Keywords Gold nanoparticles; Meldola′ blue; Eastman AQ55D; Nicotinamideadenine dinucleotide

（Received 24 June 2011; accepted 26 August 2011）