高效液相色譜-靜電場軌道阱質譜鑒定大鼠血漿中蟾蜍二烯內酯及其代謝物

摘 要 [HTSS]建立了高效液相色譜質譜鑒定大鼠口服蟾酥總內酯提取物后血漿中蟾蜍二烯內酯類化合物及其主要代謝物的分析方法。大鼠單劑量灌胃（50 mg/kg）蟾酥總內酯提取物后收集血漿樣品，乙腈沉淀蛋白，濃縮定容，采用HPLCMS分析。利用色譜保留時間、高分辨質譜提供的精確分子量和碎片離子精確質量的信息，鑒定了24種蟾蜍二烯內酯類化合物和20種可能的代謝物。其中5個化合物與相應的標準品一致。本方法快速、靈敏，適用于鑒定血漿中的微量蟾蜍二烯內酯類化合物及其體內代謝物。

關鍵詞 [HTSS]蟾酥; 蟾蜍二烯內酯; 代謝物; 血漿; 高效液相色譜； 靜電場軌道阱質譜法

1 引 言

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）等的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液， 經加工干燥而成[1]。其性味辛溫， 有毒， 具有解毒、消腫、醒神、開竅、強心和止痛等作用[2]，在臨床上被廣泛應用于治療多種癌癥、結核病、心臟病、惡性血液病、周期性面神經麻痹、急性咽炎和慢性乙肝等感染病， 還可以用于局部麻醉等[3～6]。臨床上應用的蟾酥注射液、活心丸、救心丸、蟾龍定喘合劑、喉癥丸等50余種中成藥中均含有蟾酥[6，7]。蟾酥的主要化學成分有蟾蜍內酯類、吲哚堿類、甾醇類及多肽類等[1]。其中已分離鑒定的蟾蜍二烯內酯類化合物逾40種[8～12]，被認為是蟾酥的主要藥效成分。

以往對蟾酥及其配方制劑的成分研究多側重于藥物本身蟾蜍內酯類化合物的分析[4，6，8～10]，對該類成分在體內的吸收代謝的研究報道很少[3，13～15]。而蟾蜍內酯類成分在體內的吸收和代謝研究對闡明蟾酥的藥理作用以及臨床用藥安全具有重要的指導意義。然而，蟾酥的成分復雜，給藥后經動物腸道菌群及體內代謝后成分更為復雜，而且含量低，蟾酥在動物體內的成分分析對儀器及分析技術提出了更高的要求。

近年來，液相色譜質譜聯用技術被廣泛應用于中藥及其代謝物分析，其優點在于能夠實現復雜成分的在線檢測和鑒定。質量高分辨和多級串聯功能的質譜儀與液相色譜聯用，為成分鑒定的準確性提供了更有力的保障。本研究利用高效液相色譜線性離子阱靜電場軌道阱組合式高分辨質譜聯用儀（HPLCLTQOrbitrapMS）分析鑒定了蟾蜍內酯類化合物口服給藥后在大鼠血漿中的成分及其代謝物，發現血漿中含有原藥中24種蟾蜍二烯內酯類成分和20種代謝物，初步探討了蟾蜍內酯類成分在大鼠血液中的吸收和代謝情況，本研究結果為蟾酥活性成分的體內藥理毒理作用研究提供了理論依據。2 實驗部分

2.1 儀器

SURVEYORHPLC液相色譜儀（美國Thermo Scientific公司）；LTQ Orbitrap XL組合式高分辨質譜儀（美國Thermo Scientific公司）；Poroshell SBC18快速分離型高效液相色譜柱（100 mm×2.1 mm， 2.7

SymbolmA@ m， 美國Agilent公司）；TG18M高速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；MS2型渦旋振蕩器（廣州IKA公司）。

2.2 材料、試劑與動物

日蟾毒它靈（Gamabufotalin）、沙蟾毒精（Arenobufagin）、蟾毒靈（Bufalin）、脂蟾毒配基（Resibufogenin）和華蟾毒配基（Cinobufagin）對照品（暨南大學中藥及天然藥物研究所分離并鑒定，HPLC分析純度大于98%）；蟾酥餅（山東臨沂醫藥有限公司）；甲醇和乙腈（色譜純， 美國Burdick Jackson公司）；甲酸（分析純， 廣州化學試劑廠）；實驗用水為超純水設備（美國MiliQ公司）制備的超純水。實驗動物為雄性SD大鼠（體重200～220 g，廣東省醫學實驗動物中心）。

2.3 實驗步驟

2.3.1 蟾酥總內酯的制備 將100 g蟾酥餅粉粹，以1 L 95%乙醇分兩次超聲浸提，過濾，合并濾液，減壓旋轉蒸發回收乙醇，剩余物中加入200 mL二氯甲烷超聲提取，過濾，濾液減壓旋轉蒸發回收二氯甲烷，冷凍干燥，得到蟾酥內酯類化合物（總內酯）12 g。用丙二醇溶解并定容， 得30 g/L蟾酥總內酯溶液。

2.3.2 給藥方法

雄性SD大鼠8只，禁食12 h后，其中6只50 mg/kg劑量蟾酥總內酯灌胃給藥，另2只灌胃等體積的丙二醇，給藥或丙二醇后分別在10， 20， 35， 60和120 min頸靜脈采血，每次取血約2 mL，轉入預先用0.3%肝素鈉溶液濕潤過的EP管，置于冰水中。

2.3.3 樣品處理 血樣靜置約5 min后，以3000 r/min離心8 min，吸取上清血漿，加入約2倍量的乙腈，漩渦5 min，超聲10 min，12000 r/min離心10 min，吸取上層清液，合并同一大鼠不同時間點血漿經處理后上清液，氮氣吹干，殘留物加200

SymbolmA@ L甲醇溶解，過0.45

SymbolmA@ m濾膜，待分析。

2.3.4 樣品分析

樣品采用SURVEYOR HPLC與LTQ Orbitrap XL聯用分析。Agilent Poroshell SBC18快速分離型高效液相色譜柱（100 mm×2.1 mm， 2.7

SymbolmA@ m）；流動相A為水（含0.5%甲酸），B為乙腈；0 min，80% A＋10% B；0～7 min，流動相B從0%升至30%；7～35 min， 流動相B從30%升至45%；35～40 min， 流動相B從45%升至95%； 40～45 min， 5%A+95% B；45～46 min， 流動相B從95%降至20%; 46～55 min， 80%A＋20%B。流速0.3 mL/min；進樣量1

SymbolmA@ L。離子化方式：電噴霧（ESI）正離子模式；噴霧電壓：4.5 kV；管狀透鏡電壓：80 V；鞘氣壓力：214 kPa；輔助氣壓力： 55 kPa； 掃描質量范圍：m/z 100～700；掃描模式：一級質譜質量分辨率R＝30000； 二級質譜質量分辨率R＝7500。

3 結果與討論

3.1 蟾酥總內酯的化學成分鑒定

圖1A為蟾酥總內酯樣品分析的總離子流質量色譜圖，通過分析每個色譜峰保留時間、準分子離子和碎片離子的精確質荷比（m/z），并與文獻[9，10]比較，推測出蟾酥總內酯樣品中共含有24個蟾蜍二烯內酯類化合物。每個化合物通過一級高分辨質譜的精確分子量信息推測出其可能分子式，二級高分辨質譜碎片精確m/z信息推測出離子碎片化學式，并結合其在C18色譜柱的保留時間，與文獻[9，10]比較，對24個蟾蜍二烯內酯類化合物進行了鑒定，化合物結構見圖2，詳細信息見表1（詳表見http://www.analchem.cn/table/110334.pdf）。其中日蟾毒它靈（2）、沙蟾毒精（4）、蟾毒靈（22）、華蟾毒配基（23）和脂蟾毒配基（24） 5個化合物通過與對照品的色譜保留時間、一級準分子離子和二級碎片離子質譜信息進行比較而得到了確證。圖3給出了沙蟾毒精的質譜裂解可能途徑。

3.2 大鼠血漿中蟾酥內酯類化合物及其代謝物鑒定

蟾蜍內酯通過腸道吸收和微生物轉化進入血液，其原形化合物和代謝物可能同時在血漿中存在。文獻[3，15]指出，蟾蜍內酯類化合物在體內可能發生的生物轉化主要有4類：（1） 3位羥基羰基化；（2） 3位羥基羰基化后再反向羥基化，形成差向異構體；（3） 含有乙酰基的蟾蜍內酯化合物去乙酰化，去乙酰化代謝物同時可發生（1）和（2）類轉化形成新的代謝物；（4） 某些蟾蜍內酯或其（1）和（2）類代謝物12位碳原子羥基化。由于蟾蜍內酯和代謝物在血漿中的含量較低，并且血漿樣品基體復雜，很多含量低的化合物在總離子流質量色譜圖中很難被發現。因此，采用提取離子流的方法對血漿中的原形化合物和代謝物進行分析鑒定，由于LTQOrbitrapMS提供了原形藥物和代謝物的一級和二級離子的精確m/z，通過提取一級質譜中的精確m/z離子可很容易找到原形化合物和可能的代謝物。采用提取高分辨質譜精確質量離子在復雜基體樣品中尋找目標物的準確性遠高于普通MS。根據以上4種可能的蟾蜍內酯體內生物轉化途徑，計算出24種蟾蜍二烯內酯類化合物可能的代謝物精確準分子量，與原形化合物的精確準分子量一起進行提取離子流分析，原藥中24種蟾蜍二烯內酯類成分在大鼠血液中均能檢測到，同時多檢測出20個化合物（M1～M20）。而空白血漿樣品中未檢測到該20種化合物對應的準分子離子，證明這些化合物均為蟾酥總內酯給藥后在大鼠體內的代謝物。從圖3的質譜裂解途經可以看出，沙蟾毒精與其3epi差向異構體的裂解途經與原形化合物應該是一致的，因此，通過比較二級高分辨質譜提供的精確m/z，可推斷出代謝物與原形化合物的關系。Ma等[15]研究了蟾蜍內酯、其3位羰基代謝物和其3epi羥基差向異構體代謝物在C18柱上的保留時間，發現原形化合物最先洗脫，然后為3epi差向異構體，3位羰基代謝物最后洗脫，這一規律也可用于判斷蟾蜍內酯代謝物與原形化合物之間的關系。通過以上規律對血漿樣品中新出現的20個化合物進行結構推測，詳細信息見表1。圖1B

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

Fig．2 Chemical structures of bufadienolides from ChanSu extract identified by HPLCMS[TS）]

[TS（][HT5”SS]圖3 沙蟾毒精準分子離子的質譜裂解可能途徑

Fig．3 Proposed MSn fragmentation mechanism of protonated arenobufagin[TS）]

給出了大鼠給藥后血漿樣品分析的m/z 417.2272， 403.2481， 401.2325，

415.2119， 399.2170， 457.2223， 459.2381， 473.2175， 445.2588， 443.2432， 387.2535， 385.2375和[TS（][HT5”SS] 圖4 蟾蜍它靈在大鼠體內可能發生的生物轉化過程

Fig．4 A proposed biotransformation pathway of bufotalin in rat[TS）]383.2220提取離子流質量色譜圖。圖4給出了蟾蜍它靈在大鼠體內可能發生的生物轉化過程。



根據表1鑒定結果，初步推斷M2和M3為日蟾毒它靈（2）的代謝產物，M1和M4為異沙蟾毒精（3）的代謝產物，M5， M6， M9， M13和M15為蟾蜍它靈（17）的代謝產物，M8和M10為沙蟾毒精（4）的代謝產物，M11和M12為遠華蟾毒精（15）的代謝產物，M14和M16為海蟾蜍精（21）的代謝產物，M17和M18為蟾毒靈（22）的代謝產物，M7， M19和M20為脂蟾毒配基（24）的代謝產物。

References

1 Zhang Ying， Qiu YingKun， Liu Ke， Jiang YongTao， Chen JiYong， Dou DeQiang（張 英， 邱鷹昆， 劉 珂， 姜永濤， 陳繼永， 竇德強）. Chinese Tradit. Herb. Drugs（中草藥）， 2006， 37（12）: 1905～1908

2 Zhao Qiang， Meng FanJing， Liu AnXi（趙 強， 孟凡靜， 劉安西）. Chinese Tradit. Herb. Drugs（中草藥）， 2004， 35（10）: 附4～7

3 Xia X L， Jin H Z， Yan S K， Zhang W D. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2010， 53（3）: 646～654

4 Ye M， Guo H， Guo H Z， Han J， Guo D. J. Chromatogr. B， 2006， 838（2）: 86～95

5 YIN YueFen， ZHANG XiaoLi， CHEN JunHui， Lee Frank Senchun， WANG XiaoRu（殷月芬， 張曉理， 陳軍輝， 黎先春， 王小如）. Chinese Pharm. J.（中國藥效雜志）， 2009， 44（8）: 623～627

6 ZHU LingYing， QIAN DaWei， DUAN JinAo， QIAN ShiHui， LI XinJie（朱玲英， 錢大緯， 段金傲， 錢士輝， 李欣潔）. Chinese Tradit. Pat. Med. （中成藥）， 2008， 30（5）: 625～628

7 Hong Z， Chan K， Yeung H W. J. Pharm. Pharmacol.， 1992， 44（12）: 1023～1026

8 Krenn L， Kopp B. Phytochem.，  1998， 48（1）: 1～29

9 CAO Yang， LIANG QiongLin， ZHANG HongYang ， WANG YiMing， BI KaiShun， LOU GuoAn（曹 陽， 梁瓊麟， 章弘揚， 王義明， 畢開順， 羅國安）. Chinese J . Anal. Chem. （分析化學）， 2008， 36（1）: 39～46 

10 Ye M， Guo D A. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2005， 19（13）: 1881～1892

11 Kamano Y， Nogawa T， Yamashita A， Hayashi M， Inoue M， Draar P， Pettit G R. J. Nat. Prod.， 2002， 65（7）: 1001～1005

12 Tian H Y， Wang L， Zhang X Q， Wang Y， Zhang D M， Jiang R W， Liu Z， Liu J S， Li Y L， Ye W C. Chem. Eur. J.， 2010， 16（36）: 10989～10993

13 Liang Y， Liu A H， Qin S， Sun J H， Yang M， Li P， Guo D A. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2008， 46（3）: 442～448

14 LIANG XiaoPing， ZHANG Zheng， HU Ping， ZHONG HongFu， GE ZhaoHui， ZOU TingTing， LIANG QiongLin， WANG MingYi， LUO GuoAn（梁曉萍， 張 政， 胡 坪， 鐘宏福， 葛朝暉， 鄒婷婷， 梁瓊麟，王明義， 羅國安）. China J. Chinese Universities（高等學校化學學報）， 2011， 32（1）： 38～43

15 Ma X C， Cui J， Zheng J， Guo D A. J. Mol. Catal. B: Enzymatic， 2007， 48（12）: 42～50

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Identification of Bufadienolides and Its Metabolites in Rat

Plasma by High Performance Liquid Chromatography Coupled

with Linear Trap QuadrupoleOrbitrap Mass Spectrometry

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CHEN JianXin1， DENG JieWei2， CHEN Hong1， TIAN HaiYan3， YANG YunYun2， YE WenCai*3

1（College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510640） 

2（China National Analytical Center Guangzhou， Guangzhou 510070） 

3（Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products， Jinan University， Guangzhou 510632）



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Abstract A method based on high performance liquid chromatography coupled with Linear trap quadrupole（LTQ）Orbitrap mass spectrometry （HPLCLTQOrbitrapMS） was developed for the identification of the bufadienolides and its metabolites in rat plasma. The rat plasmas were collected after oral administration of lactones from ChanSu extract （50 mg/kg）. The plasma samples were precipitated by acetonitrile and concentrated， and then analyzed by HPLCLTQOrbitrapMS. 24 bufadienolides and the 20 metabolites were identified according to their elution orders in C18 column， exact molecular weight and MS/MS fragmentation provided by highresolution MS/MS. 5 standards of bufadienolides were used for corroboration. The method is fast， sensitive and suitable to identify trace bufadienolides and its metabolites in plasma. 

Keywords Chansu; Bufadienolides; Metabolite; Plasma; High performance liquid chromatography； Linear trap quadrupoleorbitrapmass spectrometry

（Received 7 April 2011; accepted 25 July 2011）