液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間質譜法分析瓊膠寡糖

摘 要 建立超高效液相色譜電噴霧四級桿飛行時間質譜聯用技術快速分離鑒定瓊膠寡糖的方法。通過分析比較3種色譜柱（BEH Amide、BEH C8及Atlantis T3）對瓊膠寡糖的分離結果發現，Amide色譜柱具有最佳優勢，在無需樣品衍生的狀態下，可使聚合度介于3～29的瓊膠寡糖得以良好分離，分析迅速，靈敏度高。而衍生后，則是采用Atlantis T3柱分離效果最佳，在紫外吸收色譜圖上分離狀態良好。色譜通過與電噴霧四級桿飛行時間質譜聯用，能準確獲得每個色譜信號對應的質譜結構信息，譜圖清晰、簡單，歸屬容易。

關鍵詞 瓊膠寡糖； BEH Amide色譜柱； 液相色譜； 電噴霧四級桿飛行時間質譜

 20101224收稿; 20110629接受

本文系教育部長江學者與創新團隊項目 （No.IRT0734）、 浙江省公益性項目（No.2010C32021）、教育部博士點基金（No.200816460002）資助

* Email: yanxiaojun@nbu.edu.cn

1 引 言

瓊膠是海洋中含量極為豐富的多糖。瓊膠寡糖是由1，3聯接的βD半乳吡喃糖和1，4聯接的3，6內醚αL半乳吡喃糖殘基，通過反復交替聯接而生成的鏈狀中性糖（圖1），包括瓊寡糖和新瓊寡糖[1]。通常，β瓊膠酶（海洋菌株中分離出的主要瓊膠酶）可以裂解瓊膠糖的β1，4糖苷鍵，生成以βD半乳糖為還原性末端和以3，6內醚αL半乳糖為非還原性末端的新瓊寡糖（Neoagarooligosaccharides）系列；α瓊膠酶則裂解瓊膠糖的α1，3糖苷鍵，生成以βD半乳糖為非還原性未端和以3，6內醚αL半乳糖為還原性末端的瓊寡糖（Agarooligosaccharides）系列[2]。研究發現，新瓊寡糖沒有顯著的生理活性，而瓊寡糖則具有多種活性，且這些活性與寡糖的聚合度（Ddegree of polymerization，DP）密切相關，此性質在瓊寡糖藥物開發及植物病害防御方面起重要作用[3]。關于不同聚合度寡糖的制備方法研究已有報道[4]，建立一種快速、靈敏、穩定的寡糖定性分析方法，實時監控寡糖水解進程以及實現進一步生化分析尤為重要。

[TS（] 圖1 瓊膠寡糖的結構

Fig．1 Structure of agarooligosaccharide[TS）]

高效液相色譜（HPLC）具有快速、靈敏和樣品處理簡單等優點，已成為糖類分析的重要工具。有研究者采用反相離子對色譜法分析寡糖[5]，但該方法存在柱穩定時間較長、質譜分析中本底干擾高等不足；也有研究者采用柱前衍生紫外或熒光檢測法，但樣品衍生操作復雜，耗時耗力[6]，限制了寡糖相關的深入研究。

由于分析方法的局限性，至今還未見分離鑒定瓊膠寡糖數超過22的報道[7]。本研究以瓊膠寡糖為研究對象，利用超高效液相色譜四極桿飛行時間質譜（UPLCQTOFMS）系統，選用Amide色譜柱，在無需樣品衍生的狀態下使聚合度介于3～29的瓊膠寡糖得以成功分離，并可獲得其準確質譜信息，結果優于對照組采用柱前衍生在反相色譜柱C8和T3上的分析結果。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑 

ACQUITY超高效液相色譜分析系統，配置ACQUITY自動進樣器；QTOF Premier高分辨四極桿與飛行時間串聯質譜儀；Atlantis T3色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5.0

SymbolmA@ m），ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7

SymbolmA@ m），ACQUITY UPLC BEH C8色譜柱（100 mm×2.1 mm， 1.7

SymbolmA@ m）；MassLynx 4.1數據處理系統，以上均為美國Water公司產品；R215旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；FD5508冷凍干燥儀（美國SIM公司）；W0系列恒溫水浴鍋、S212系列恒速攪拌器（上海申順公司）；超純水系統（法國Millipore公司）。

瓊脂（福建泉州市泉港化工廠）；甲醇、乙腈（色譜純，美國SigmaAldrich公司）；超純水由超純水系統制備。

2.2 瓊膠寡糖制備與衍生 

瓊膠寡糖制備：稱取適量瓊膠，用0.1 mol/L HCl配制成1.5%反應溶液，以400～500 r/min的速度充分攪拌， 在50℃降解5 h，用1 mol/L NaOH中和，旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥，備用。

瓊膠寡糖衍生：稱取1 mg瓊膠寡糖樣品于聚四氟乙烯墊片的螺旋蓋試管中，加入10

SymbolmA@ L水和40

SymbolmA@ L衍生劑（由1 mmol α萘胺、35 mg硼氰氫化鈉、41

SymbolmA@ L冰醋酸和450

SymbolmA@ L甲醇混合配制而成），在80 ℃反應30 min后， 冷卻至室溫，加入水和氯仿各1 mL，混均后靜置分層，取水相層進行液質分析。

 分 析 化 學第39卷

第12期許艷婷等： 液相色譜電噴霧四級桿飛行時間質譜法分析瓊膠寡糖 

2.3 色譜與質譜條件 

ACQUITY UPLC BEH Amide柱色譜條件：柱溫50 ℃，流動相A為0.1%氨水乙腈溶液、B為水甲醇（2∶1，V/V）溶液。洗脫梯度：0～5 min，40％ B；5～10 min，40%～50% B；10～15 min，50% B；15～20 min，50%～5% B；保持5 min。進樣量5

SymbolmA@ L，流速0.25 mL/min。

ACQUITY UPLC BEH C8柱色譜條件：柱溫35 ℃，流動相A為水、B為甲醇。洗脫梯度：0～1 min，5%～35% B；1～6 min，35% B；6～10 min，35%～100% B；10～15 min，100% B。進樣量5

SymbolmA@ L，流速0.35 mL/min，同時開啟紫外檢測器，檢測波長243 nm。

Atlantis T3柱色譜條件：柱溫35 ℃，流動相A為水、B為甲醇。梯度洗脫：0～3 min，10%～20％ B；3～35 min，20%～80％ B；35～36 min，80%～100% B；36～46 min， 100% B。進樣量5

SymbolmA@ L，流速0.20 mL/min，同時開啟紫外檢測器，檢測波長243 nm。

質譜條件：采用電噴霧電離（ESI）源，分別在正、負離子電離模式下進行質譜分析。TOF離子飛行方式采用V模式。離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度350 ℃，脫溶劑氮氣流速800 L/h，錐孔反吹氮氣50，碰撞室能量6 V，四極桿掃描范圍m/z 100～3000。儀器在使用前用甲酸鈉進行質量線性校正，使用0.5 mg/L亮腦啡肽作為外標物對目標離子進行精確質量鎖定。采用正離子電離模式時，毛細管電離電壓2.8 kV，取樣錐孔電壓30 V；采用負離子電離模式時，毛細管電離電壓2.5 kV，取樣錐孔電壓25 V。

3 結果與討論

3.1 瓊膠寡糖的高效液相色譜分離

未經衍生的瓊膠寡糖采用BEH Amide柱梯度洗脫（圖2）。寡糖按聚合度由低到高依次在BEH Amide柱上得到最佳分離。在總離子流色譜圖中正負離子模式下均可以觀察到最大聚合度為21的色譜信號，而根據寡糖質譜學特征，用提取離子色譜流的方式，在正離子模式下，最高可以觀察到二十九糖；在負離子模式下，最高可以觀察到二十七糖（圖3）。以兩糖單位聚合度增加的寡糖主峰色譜信號隨保留時間延長而依次出現，主要出峰時間位于2～17 min。在負離子模式下，總離子流色譜圖中從十一糖到十九糖峰的前沿均可見一個小峰，其為DP＋1的偶數糖峰；在正離子模式下，由于靈敏度較低，偶數糖信號不明顯。

[TS（] 圖2 瓊膠寡糖在Amide柱上的色譜分離

Fig．2 Total ion current chromatogram of agarooligosaccharides separated by Amide chromatographic column

A1. 正離子模式下，瓊膠寡糖的總離子流圖（Total ion current chromatogram of agarooligosaccharides in positive mode）；A2， A3. 奇數糖、偶數糖的提取離子流圖（A2， A3 were extracted ion current chromatogram of odd and even sugars separately）；B1：負離子模式下，瓊膠寡糖的總離子流圖（Total ion current chromatogram of agarooligosaccharides in negative mode）；B2，B3： 奇數糖、偶數糖的提取離子流圖（B2， B3 were extracted ion current chromatogram of odd and even sugars separately）。[TS）]

[TS（] 圖3 提取離子色譜流中可觀察到的瓊膠寡糖

Fig．3 Theagarooligosaccharides observed in extracted ion current chromatogram[TS）]

為了克服糖類物質檢測靈敏度低、極性大， 在反相柱上不易保留的難題，多采用樣品柱前衍生方法[8]，使之攜帶紫外或熒光基團，可提高檢測靈敏度，還可使糖鏈分子攜帶疏水集團，降低糖鏈的極性，使之在反相色譜柱上的保留增強。為比較此方法與直接用Amide柱分離方法，采用α萘胺（αNA）柱前衍生后進行反相色譜分離，衍生后不同聚合度的瓊膠寡糖在反相柱上出峰次序與在Amide柱上相反（圖4）。

對瓊寡糖進行衍生后，多都選擇C8柱進行分離[7]。本實驗選擇1.7

SymbolmA@ m 粒徑柱材料的BEH C8柱進行分離，主要出峰時間在3～5 min。在紫外吸收光譜圖上，三糖和五糖可得到較好分離，從七糖到十七糖分離欠佳，十七糖之后觀察不到獨立紫外吸收色譜峰（圖4A1），而且絕大多數紫外吸收峰都無法達到基線分離。質譜信號峰的分離效果更差（圖4A2）。

而用5.0

SymbolmA@ m粒徑柱材料的T3柱分離效果明顯優于C8，但瓊膠糖出峰時間主要在3645 min，耗時較長。色譜圖中可以觀察到明顯的從三糖到十九糖的紫外吸收峰（圖4B1），而且基本達到基線分離，但十三糖之后質譜信號靈敏度較低（圖4B2）。由于紫外吸收強度只跟樣品中瓊寡糖衍生上去的α萘胺量成正比，而每一分子的瓊寡糖只衍生一個分子的α萘胺，所以樣品中各聚合度寡糖相對于總寡糖的紫外相對強度即可表示各寡糖相對總寡糖的量，從而可以利用此方法對樣品中的寡糖組成進行相對定量分析。在本實驗中，相鄰的偶數與奇數糖在紫外檢測中的響應信號基本完全重疊，一個色譜峰中包含了相鄰偶數與奇數糖的信號，由于在正離子模式下各寡糖衍生物質譜峰信號基本均是[M＋H]＋峰，故可根據各寡糖[M＋H]＋提取離子信號的相對高低計算出重疊峰中相鄰偶數與奇數糖的比例，從而實現所有寡糖的相對組成的定量分析。寡糖衍生物很不穩定，在25 ℃室溫條件下，一般需在12 h內完成實驗[9]，否則信號強度將明顯減弱，這也是利用該方法進行寡糖研究的最大局限。

[TS（]圖4 瓊膠寡糖在反相柱上的色譜分離

Fig．4 Total ion current chromatogram of agarooligosaccharides separated by reversedphase chromatographic columns

注（Note）： A. 負離子模式下，運用C8柱分離得到的紫外吸收圖（A1）及TIC圖（A2）（The ultraviolet spectra （A1） and total ion current chromatogram （A2） separated by C8 in negative mode）; B. 負離子模式下，運用T3柱分離得到的AU圖（B1）及TIC圖（B2）（The ultraviolet spectra （B1） and total ion current chromatogram （B2） separated by T3 in negative mode）。峰頂上的數字表示瓊膠寡糖聚合度（The numbers above the peak represent oligoKcarageenan of monosaccharide unit）。[TS）]

3.2 寡糖的質譜特征

采用電噴霧電離（ESI）源對未經衍生的樣品進行高分辨質譜分析。在正、負離子模式下，分別可以得到聚合度3～29和3～27的奇數糖清晰質譜信號（表1），相鄰偶數糖的質譜學規律類似，但信號較弱。

未經衍生的瓊膠寡糖ESIMS譜圖清晰、簡單，歸屬容易，能準確判斷出化合物的分子量。在正離子模式下，從三糖到九糖，單電荷分子離子為基峰（圖5A1）；十一糖開始出現雙電荷分子離子，但單電荷分子離子仍然是基峰；從十三糖到二十七糖，以雙電荷分子離子為基峰，十五糖起出現三電荷離子（圖5B1），二十九糖則以三電荷分子離子為基峰；另外，三糖到七糖還出現了2M系列的離子，三糖中甚至還有[3M＋NH4]＋。可見，隨著聚合度的增加，寡糖很容易出現多電荷分子離子。這些分子離子峰均以[M＋nNH4]n＋信號豐度最高，[在負離子模式下，九糖就開始出現雙電荷分子離子，十一糖起以雙電荷分子離子為基峰，十七糖起出現三電荷離子，二十五糖起以三電荷分子離子為基峰，形成的均為去質子準分子離子峰[M－nH]n－（圖5A2， B2）。在所采用的色譜質譜條件下，可以得到小于二十七糖的清晰結構信息。瓊膠寡糖容易出現多電荷分子離子以及容易產生加鈉峰的質譜規律與文獻[10]的結果基本一致，但該文獻中6種寡糖（偶數糖，聚合度為2～12）均未發現[M＋H]＋的準分子離子峰。

衍生后瓊膠寡糖正、負離子模式下分別出現[M＋nH]n＋， [M－nH]n－的準分子離子基峰（圖6），同樣容易出現多電荷分子離子及2M乃至3M系列離子，與未衍生寡糖的質譜規律類似。

[TS（]圖6 瓊膠五糖經α萘胺衍生后的質譜圖

Fig．6 ESIMS spectra of pentasaccharideαnaphthylamine derivative

A. 正離子模式（Positive mode）; B. 負離子模式（Negative mode）。[TS）]

測定多糖及其衍生物的分子量，常用方法有超速離心法、高壓電泳法、膜滲透壓法、粘度法和光散射法等，這些方法對于低分子量糖類誤差很大。質譜憑借其靈敏度高，樣品用量少的優點，在糖類分析中得以廣泛應用。樣品的揮發性和熱穩定性不同，采用不同的電離方式會得到不同的結果。在糖類化合物的結構分析中，快原子轟擊質譜（FABMS）曾發揮重要作用，它能夠提供分子量信息的準分子離子峰和化合物結構信息的碎片峰，但測試所用樣品量多，基質干擾大，并且只能產生單電荷離子，因此不適用于分析分子量超過分析器質量范圍的分子。電噴霧電離（ESI）作為一種新穎的電離技術，對大分子化合物分子量測定有了重要突破。它采用軟電離方式，可以測定完整的糖鏈分子質量，得到的分子離子通常帶有多個電荷，將質譜分子量檢測范圍增加。本實驗證明，ESIMS能準確判斷出瓊膠寡糖的分子量，其圖譜簡單，歸屬容易。

文獻報道中，分離鑒定的瓊膠寡糖多為偶數糖[4，10]，而本實驗結果則表明瓊膠降解產物中奇數糖與偶數糖并存，并且以奇數糖為主。由此可見，瓊膠寡糖水解具有多樣性及復雜性的特點，建立一種靈敏、穩定的寡糖定性分析方法顯得尤為重要。



References

1 Lahaye M， Yaphe W. Carbohydr. Res.， 1989， 190（1）： 249～265

2 Karlsson A， Singh S K． Carbohydrate Polymers， 1999， 38（1）： 7～15 

3 Weinberger F， Richard C， Kloareg B， Kashman Y， Hoppe H G， Friedlander M. J. Phycol.， 2001， 37（3）： 418～426



4 CHEN HaiMin， YAN XiaoJun， ZHENG Li， ZHANG WeiWei（陳海敏， 嚴小軍， 鄭 立， 張偉偉）． Journal of Zhengzou Institute of Technology（鄭州工程學院學報）， 2003， 24（3）： 41～44

5 MU Qing， ZHANG Ying， HUANG LinJuan， WANG ZhongFu（牟青， 張英， 黃琳娟， 王仲孚）． Chinese Journal of Chromatography（色譜）， 2009， 27（1）： 24～28

6 WANG WeiTong， CHEN QiJuan， CHAI WenGang（王維通， 陳琪娟，柴文剛）. Chinese Biochemical Jornal（生物化學雜志）， 1988， 4（2）： 116～123

7 Chen H M， Zheng L， Lin W， Yan X J. Talanta， 2004， 64（3）： 773～777

8 Royle L， Mattu T S， Hart E， Langridge J I， Merry A H， Murphy N， Harvry D J， Dwek R A， Rudd P M. Analytical Biochemistry， 2002， 304（1）： 70～90

9 CHEN HaiMin（陳海敏）， The Hydrolysis， Labeling Analysis， Structure Elucidation and Bioaetivity Researeh of Agarobiose Oligopolymers（瓊二糖寡聚體特效降解、標記分析、結構特征與生物活性的研究）， Qingdao（青島）： Institute of oceanology， Chinese academy of sciences（中國科學院海洋研究所）， 2004 

10 MAO WenJun， LIN Hong， GUAN HuaShi（毛文君， 林 洪， 管華詩）． Journal of Fishery Sciences of China（中國水產科學）， 2001， 8（3）： 69～72



Analysis of Agarooligosaccharide by Liquid Chromatography Coupled with

Electrospray IonizationQuadrupoleTime of FlightMass Spectrometry



XU YanTing， WANG XiuJuan， SU XiaoLing， XU JiLin， CHEN HaiMin， CHEN JuanJuan， YAN XiaoJun*



（Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology， Ningbo University， Ministry of Education， Ningbo 315211）





Abstract A method was developed to isolate and identify agarooligosaccharides by ultra performance liquid chromatographyelectrospray ionizationquadrupoletime of flight mass spectrometry （UPLCESIQTOFMS）. In the experiment， three chromatographic columns （BEH Amide， BEH C8 and Atlantis T3） were used to isolate agarooligosacchrides. It was found that the BEH Amide had excellent isolation effect. Agarobiose oligomers with degree of polymerization （DP） ranging from 3 to 29 could be isolated rapidly and sensitively， and no derivatization procedure was needed. However， after derived with αnaphthylamine， agarobiose oligomers could be separated better by Atlantis T3 column， and a perfect AU spectrum was obtained. When combined liquid chromatography with ESIQTOFMS， accurate structure information of each chromatogram peak was obtained， the spectra were clear and the molecular weight of those oligosacchandes could be assigned easily. 

Keywords Agarooligosaccharides; Amide chromatogram column; Liquid chromatography; Electrospray ionizationquadrupoletime of flightmass spectrometry

（Received 24 December 2010; accepted 29 June 2011）