多態性及基因測序分析方法研究苯丙酮尿癥患者的基因突變

摘 要 應用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性分析及基因測序的方法，分析35例苯丙酮尿癥患者PAH基因第6和7外顯子以及其兩側部分內含子序列，進行了突變的篩查和確定。研究吉林地區苯丙酮尿癥人群中苯丙氨酸羥化酶（Phenylalanine hydroxylase， PAH）基因突變特征。結果顯示: （1） 在70個PAH等位基因中共檢測出9種不同突變基因，總檢出率為44.2%。吉林地區常見的突變是R243Q和EX6－96A＞G，其它較常見突變有IVS7＋2T＞A， R241C， L242F， G247R， G247V， R261X和R176X。（2） 檢測出兩種多態性位點Q232Q和V245V，推測PAH基因 cDNA序列存在人種差異和地域差異。明確了吉林地區PAH在第6和第7外顯子基因及其兩側部分內含子突變類型與中國其它地區相似，高頻率突變位點基因突變比例幾乎一致，而其它突變位點的基因突變比例存在明顯差異。

關鍵詞 苯丙酮尿癥； 苯丙氨酸羥化酶； 基因突變

1 引 言

苯丙酮尿癥（Phenylketonuria， PKU）是由于肝臟苯丙氨酸羥化酶（Phenylalanine hydroxylase， PAH）缺乏或活性減低而導致苯丙氨酸代謝障礙的一種常染色體隱性遺傳性疾病。目前世界范圍內已經報道的突變種類有564種（http://www.pahdb.mcgill.ca/），我國國內報道的突變種類也有100余種[1，2]。中國人群中PKU的發病率為1/11000[3]，在吉林地區的發病率較高，約為1/3885[4]。本研究選取了中國PKU人群中在PAH上有較高突變頻率第6和7外顯子及其兩側部分內含子為研究對象，利用聚合酶鏈反應單鏈構象多態性分析及基因測序的方法研究吉林地區PAH基因突變分布特征。

2 實驗部分

2.1 樣品采集 

采集來自吉林省婦幼保健院和長春市婦保所新生兒篩查中心確診的35例PKU患者的樣品，樣品為新生兒篩查時所用的干燥濾紙血斑。所有患者血苯丙氨酸濃度＞120

SymbolmA@ mol/L，并應用尿碟呤譜分析、四氫生物碟呤負荷實驗及血紅細胞二氫生物喋啶還原酶活性測定排除四氫生物喋呤缺乏癥。

2.2 分析方法

2.2.1 基因組DNA提取 取每例患兒的干濾紙血斑3片（直徑為3.2 mm），使用Omega公司生產的E.Z.N.A. 法醫學DNA提取試劑盒提取每個患者的基因組DNA，提取后置于－20 ℃保存。

2.2.2 PCR反應 引物參考文獻[5]設計合成，序列分別為：

PCR反應在ABI GeneAmp 2700型擴增儀上完成。反應總體積20

SymbolmA@ L，其中含 1.2 U Taq DNA聚合酶和1×反應緩沖液，0.5 pmol/L上下游引物等。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物用2%瓊脂糖檢測。

2.2.3 單鏈構象多態性（Single strand conformation polymorphism， SSCP）分析



取5

SymbolmA@ L PCR產物與10

SymbolmA@ L的變性緩沖液（含0.25 g/L溴酚藍，0.25 g/L二甲苯青FF，98%去離子甲酰胺）混勻，100 ℃變性10 min，迅速取出置于冰浴中，上樣于10%和8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳3～6 h，電泳條件為15～20 ℃，恒流30 mA或恒電壓400 V。電泳結束后進行常規銀染，分析并記錄單鏈DNA帶型。

2.2.4 序列測定 采用 PCR產物直接測序的方法，樣品純化及序列分析由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，應用 ABI 3730XL全自動DNA測序儀通過雙向測序序列分析確定突變類型。

 分 析 化 學第39卷

第12期王春艷等: 多態性及基因測序分析方法研究苯丙酮尿癥患者的基因突變 

3 結果與討論

3.1 PAH基因Exon 6和Exon 7突變分析



在70個PAH等位基因中，共檢測出9種不同的突變基因，等位基因檢出率為44.2%（31/70），見表1。其中錯義突變5種、無義突變2種和剪切位點突變2種，突變頻率分別為33.8%， 2.8%和8.6%。吉林地區常見的突變基因為R243Q（25.7%）和EX6－96A＞G（5.7%），其它的突變頻率相對低一些，分別是R241C（2.9%）， L242F（1.4%）， G247R（1.4%）， G247V（1.4%）， R261X（1.4%）， IVS7＋2T＞A（2.9%）和R176X（1.4%），部分基因突變SSCP譜圖如圖1所示，部分基因突變測序譜圖如圖2所示。

3.2 PAH基因Exon 6和Exon 7中的基因多態性 

在吉林地區PKU人群PAH等位基因中，發現了兩個同義突變，分別是Q232Q和V245V，它們的突變頻率分別是94.3%

3.3 吉林地區與其它地區PKU人群PAH基因突變譜圖的比較

PKU的致病基因PAH由編碼區的13個外顯子和非編碼區的12個內含子組成，當編碼區及其兩側內含子有基因突變發生時，會引起PAH的功能減低或缺失，從而導致相應的臨床表現。中國人PAH基因突變集中在外顯子 3，6，7，11與12，其中以外顯子 6與7的突變頻率最高，所以本實驗選擇吉林地區PKU人群PAH的外顯子 6與7及其兩側內含子進行研究分析。

PAH基因突變有明顯的地域性差異，亞洲國家如韓國和日本等發生的高頻率突變與中國有相同的趨勢，但是其它低頻率突變也有一定的差異。而與歐美等其它國家相比，差異性特別顯著，例如中國PKU人群在第7外顯子中突變頻率最高的R243Q，在歐美的PKU人群中很少出現，他們的高頻率突變集中于外顯子12上，如R408W，而中國PKU人群集中于外顯子7上。中國PKU人群PAH在外顯子6中的突變主要是EX6－96G＞A，其它突變在該外顯子上頻率都很低，而歐美國家除了有該突變外， F233L和E178G等在外顯子6上也有較高突變頻率。

國內已報道的外顯子6中已發現13種突變，外顯子7中已發現25種突變[1，2]，而在吉林地區外顯子6和7的突變相對集中，外顯子6發現了2種突變，外顯子7發現了7種突變，其中L242F是我國第二次報道，另外8種突變分別是R176X，EX6－96A＞G，R241C，R243Q，G247R，G247V，R261X和IVS7＋2T＞A，它們在中國PKU人群中有過多次報道。其中R243Q和EX6－96A＞G是最常見的，在中國其它地區已報道的文獻中它們都能同時被檢測出，并有較高突變頻率，而另外其它7種突變由于地域差異，在同一地區被同時檢測出的幾率很小，呈現為散發性的突變，每種突變頻率也相對很低。表2 對于吉林地區PAH中R243Q和EX6－96A＞G基因突變頻率與中國其它地區以及亞洲其它國家作了比較，由文獻[2]報道及本實驗結果可以發現，中國PKU人群中R243Q的突變頻率是所有突變中最高的，其次是EX6－96A＞G。吉林地區PKU人群的PAH第6和7外顯子及其兩側內含子的基因突變趨勢與中國其它地區是一致的，只是突變頻率的高低稍有差別，尤其是沿海城市（浙江地區）R243Q和EX6－96A＞G的突變頻率趨勢與韓國和日本相似，突變頻率相對降低。

PAH由四個苯丙氨酸羥化酶單體相互作用構成一個四聚體，作為該酶的功能單位。四聚體中的每個單體都由3個結構域組成：調節域，作為酶活性中心的催化域，以及把四個單體分子組裝成四聚體的四聚體化結構域。EX6－96A＞G和R243Q均位于催化域上。Ellingsen等[15]已經證實EX6－96A＞G突變產生了新的剪接位點，影響了 RNA的剪接，而對于R243Q突變后對于PAH活性影響的機理尚不明確。Kim等[16]對此作了初步的研究，研究結果表明，當基因突變728G＞A發生時，PAH中位于催化域表面的

第243位上氨基酸由精氨酸變為谷氨酸，由于谷氨酸側鏈旋轉后與第129位上的天冬氨酸之間的最小距離比精氨酸與天冬氨酸之間的距離增大了一倍，使這兩個位點之間原來存在的氫鍵作用消失了，如圖3所示[16]。盡管目前對于R243Q基因突變所產生的致病機理未確定，但基因突變發生后，PAH穩定性的確降低。本實驗中的35例PKU患者中有14例是R243Q純合或雜合突變，結合臨床的檢驗分析，PKU患者有R243Q純合突變時，血Phe濃度＞1200

SymbolmA@ mol/L，飲食中Phe的耐受量＜20 mg/（kg#8226;d），生化代謝表型均為經典型[17]。基因型與表型相關性研究通常是根據不同基因突變程度設定一個人為的值 （Assigning value，AV）[17]，導致不同效應的突變時，AV分別為 1，2，4，8，再通過兩個基因突變的AV總和值，對臨床生化代謝表型進行PKU預測。例如，R243Q純合突變時的AV是2，即為經典型PKU。以上結果說明基因型與臨床生化表型有良好的相關性，并與Shen等[11]的研究結果一致。

[TS（]圖3 R243Q中側鏈氫鍵作用的圖例［16］

Fig．3 View of sidechain hydrogen bonding in R243Q［16］[TS）]

在吉林地區PKU人群中PAH第6和7外顯子中檢測到兩個多態性位點，分別是Q232Q和V245V，突變頻率分別為94.3%和67.1%。我國其它地區PKU人群在這兩個位點的相關文獻報道如下：天津地區V245V突變頻率為79.5%[18]；浙江地區Q232Q和V245V的突變頻率分別為15.4%和76.9%[11]；中國北方地區Q232Q和V245V的突變頻率分別為89.0%和81.9%[19]。而歐洲人群在這兩個位點上的突變頻率均不高于3%[20]。推測PAH基因cDNA 序列在c.696和c.735位點堿基種類存在人種差異，也存在地域上的差異，如Q232Q在北方地區與浙江之間突變頻率差異很大。

綜上所述，吉林地區PAH在第6和7外顯子基因突變類型與我國其它地區相似，高頻率突變位點幾乎一致，其它突變位點存在地域性差異。其中R243Q是我國PKU人群PAH基因突變頻率最高的位點，所以關于它的研究對我國PKU群體有很重要的意義。本研究結果有助于吉林地區開展PAH基因突變攜帶者篩查，為產前診斷和確定PKU患兒PAH基因突變提供依據，提高出生人口素質。



致 謝 感謝吉林大學公共衛生學院的張萱和關松磊對本工作給予的幫助



References

1 Song F， Qu Y J， Zhang T， Jin Y W， Wang H， Zheng X Y. Mol. Genet. Metab.， 2005， 86（S1）: 107～118

2 Zhu T W， Qin S Y， Ye J， Qiu W J， Han L S， Zhang Y F， Gu X F. Pediatr. Res.， 2010， 67（3）: 280～285

3 GU XueFan， WANG ZhiGuo（顧學范， 王治國）．Chin. J. Prev. Med. （中華預防醫學雜志）， 2004， 38（2）: 99～102

4 ZHAO Ying（趙 英）. China. Modern. Doctor. （中國現代醫生）， 2010， 48（1）: 146～147

5 Guldberg P， Romano V， Ceratto N，Bosco P， Cluna M， Indelicato A， Mollica F， Meli C， Glovanlni M， Rlva E， Blasuccl G， Henrlksen K F， Guttler F. Hum. Mol. Genet.， 1993， 2（10）: 1703～1707

6 ZHANG JunLi， MENG Jun， ZHAI XiaoPing， FANG Gen， GAO JianGang， SHI Min， WANG YongXiang（張軍力， 孟 峻， 翟曉萍， 方 根， 高建鋼， 史 珉， 王永祥）. Clin. J. Med. Gene. （中華醫學遺傳學雜志）， 2005， 22（2）: 134～137

7 YU WuZhong， QIU DongHui， SONG Fang， LIU Li， LIU ShaoMing， He XinJian， JIN YuWei， ZHANG YanLing， ZOU HongYun， HE Jiang， LEI Quan， LIU XingWen（余伍忠， 仇東輝， 宋 昉， 劉 麗， 劉紹明， 何新建， 金煜煒， 張燕鈴， 鄒紅云， 何 江， 雷 權， 劉興文）. Clin. J. Med. Genet. （中華醫學遺傳學雜志）， 2009， 26（1）: 26～30

8 WANG FengYu， SHAO ChunJun， FENG HuiGen， LI CongMin（王鳳羽， 邵諸君， 豐慧根， 李聰敏）. Clin. J. Med. Gene. （中華醫學遺傳學雜志）， 2010， 27（6）: 644～649

9 SONG Li， DANG LiHeng， MENG YingTao， FU BoJin （宋 力， 黨利亨， 孟英韜，付伯津）. Clin. J. Med. Gene. （中華醫學遺傳學雜志）， 2010， 27（1）: 7～12

10 YAN YouSheng， WANG Zheng， HAO ShengJu， MENG Yan， ZHENG Lei， HUANG ShangZhi （閆有圣， 王 錚， 郝勝菊， 孟 巖， 鄭 雷， 黃尚志）. Clin. J. Med. Genet. （中華醫學遺傳學雜志）， 2009， 26（4）: 419～422

11 Shen D Y， Wu W， Zhao Z Y. Genes. Genom.， 2009， 31（1）: 85～88

12 WANG Ning， ZHU YueChun， XU Kui， QIU ZhiMing， SONG WenFeng， HUANG ShangZhi（汪 寧， 朱月春， 徐 葵， 邱志明， 宋文鳳， 黃尚志）. Clin. J. Med. Gene. （中華醫學遺傳學雜志）， 1999， 16（1）: 9～11

13 Lee Y W， Lee D H， Kim N D， Lee S T， Ahn Y J， Choi T Y， Lee Y K， Kim S H， Kim J W， Ki C S. Exp. Mol. Med.， 2008， 40（5）: 533～540

14 Okano Y， Asada M， Kang Y，Nishi Y， Hase Y， Oura T， Isshiki G. Hum. Genet.， 1998， 103（5）: 613～618

15 Ellingsen S， Knappskog P M， Eiken H G. Hum. Mutat.， 1997， 9（1）: 88～90

16 Kim S W， Jung J， Oh H J， Kim J， Lee K S， Lee D H， Park C， Kimm K， Koo S K， Jung S C. Clin. Chim. Acta， 2006， 365（12）: 279～287

17 Guldberg P， Rey F， Zsehoeke J. Am. J. Hum. Genet.， 1998， 63（1）: 71～79

18 SONG Li， XU FengDuo， MENG YingTao， WANG XiuLan， LIU CuiJun， GAO WenYing， SHAN ZhongMin， LIU ChunJie， DING ZhaoQin（宋 力， 徐鳳鐸， 孟英韜， 王秀蘭， 劉翠筠， 高文英， 單忠敏， 劉純潔， 丁肇琴）. Tianjin Med. J.（天津醫藥）， 2001， 29（7）: 419～420

19 SONG Fang， QU YuJin， YANG YanLing， JIN YuWei， ZHANG YuMin， WANG Hong， YU WuZhong（宋 昉， 瞿宇晉， 楊艷玲， 金煜煒， 張玉敏， 王 紅， 余伍忠）. Clin. J. Med. Genet. （中華醫學遺傳學雜志）， 2007， 24（3）: 241～246 

20 O′Donnell K A， O′neill C， Tighe O， Giorgio B， Naughten E， Mayne P D， Croke D T. Eur. J. Hum. Genet.， 2002， 10（9）: 530～538



Polymorphism and Sequencing Analysis of Mutations in

Patients with Phenylketonuria



WANG ChunYan1，2， ZHANG WenYan3， PI ZiFeng1， LIU ZhiQiang1，

SONG FengRui*1， Liu Ying3， Li ZhenLai4

1（Chang Chun Institute of Applied Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022）

2（Graduate School of the Chinese Academy of Sciences， Beijing 100039）

3（Jilin Center of Newborn Screening， Maternal and Child Health Hospital， Changchun 130061）

4（Changchun Women and Child health Care Institute， Changchun 130051）



Abstract The mutations in exons 6 and 7 and the flanking intronic sequence of phenylalanine hydroxylase （PAH） gene were detected by PCR/single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and direct DNA sequencing in 35 PKU patients. The characteristics of the exon 6 and exon 7 of PAH gene mutation in patients with phenylketonuria （PKU） in Jilin were also investigated and discussed. The results suggested that: （1） Nine different mutations were identified in 31/70 alleles （44.2%）. The most prevalent mutations were R243Q （25.7%） and EX696A＞G （5.7%）， followed by IVS7＋2T＞A （2.9%）， R241C （2.9%）， L242F （1.4%）， G247R （1.4%）， G247V （1.4%）， R261X （1.4%） and R176X （1.4%）. （2） Two polymorphism sites Q232Q （94.3%） and V245V （67.1%） were detected， which suggest that the ethnic diversity and area diversity exist in PAH cDNA sequence. The mutations of the PAH gene in Jilin were similar as that in other areas of China. There is identical with each high frequency of mutation and obvious difference with each other low frequency of mutation.

Keywords Phenylketonuria; Phenylalanine hydroxylase; Gene mutation

（Received 22 March 2011; accepted 21 June 2011）