離子對反相液相色譜法分析硫代寡核苷酸藥物流感泰得的有關物質

摘 要 建立了離子對反相液相色譜（IPRPLC）分析流感泰得（Flutide）有關物質的方法，并將其與其它兩種常用方法（離子交換色譜（IEC）和毛細管凝膠電泳（CGE）法）的分析結果進行比較。合成了Flutide及其單核苷酸縮短序列5′n－1、3′n－1和單氧代序列5′（P＝O）1，將它們作為已知雜質，在IPRPLC上進行分離條件的優化，使用的分析柱為XTerra MS C18柱（250 mm×4.6 mm， 3.5

SymbolmA@ m）；流動相A為142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA10%甲醇（V/V），流動相B為甲醇；梯度洗脫；流速為0.5 mL/min；柱溫為50℃；檢測波長為260 nm。結果表明，在該條件下，Flutide能同時與這幾種雜質進行分離，其中與縮短序列5′n－1和3′n－1可實現基線分離，而與5′（P＝O）1之間的分離度也能達到0.94。所建立的IPRPLC方法已成功應用于Flutide粗品和純品中各類雜質的分析和鑒定。

關鍵詞 離子對反相液相色譜； 硫代反義寡核苷酸； 流感泰得； 質量控制; 雜質

1 引 言

隨著生物技術市場的發展，反義寡核苷酸藥物得到了廣泛的應用，尤其是硫代反義寡核苷酸（PSODN），通過對核酸骨架中非橋鍵氧原子的硫代修飾，增加了對核酸酶的穩定性，提高了反義活性，并且顯示了良好的藥代動力學性質，具有廣闊的藥學應用前景[1～4]。盡管寡核苷酸自動合成是一個高效率過程，但每一步仍會產生少量雜質。據報道[5]，人工合成硫代寡核苷酸的雜質主要包括缺失核苷酸的縮短序列（n－x）和少量硫代不完全序列（P＝O）x。這些雜質常用的分析方法主要為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、毛細管電泳（CE）和離子交換色譜（IEC）等[6]。近年來，離子對反相液相色譜（IPRPLC）通過與質譜的聯用，已成為核酸藥物質量控制和體內外代謝產物研究的重要分析手段[7，8]。

流感泰得（Flutide）是本實驗室篩選獲得的一條以流感病毒基因組RNA的5′非編碼區（UTR）為靶、全長13個堿基的硫代修飾反義寡核苷酸藥物，體內外藥效學評價研究證明其具有較好的抗病毒活性[9]。為了對該反義核酸藥物進行質量控制，本研究建立了一種改進的IPRPLC方法，采用HFIP/TEA作為離子對試劑，并對離子對試劑濃度和洗脫梯度等條件進行了系統優化，獲得了同時分離Flutide全長序列（n）與縮短序列雜質5′n－1， 3′n－1，以及單氧代序列雜質5′（P＝O）1的分析條件，并采用電噴霧質譜（ESIMS）進行了結構確認。同IEC和CGE比較，該方法提供了更好的分離選擇性，且操作更為便捷。該方法已成功應用于Flutide粗品和純品的雜質分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

三乙胺（TEA，純度99.5%）、1，1，1，6，6，6六氟異丙醇（HFIP，純度＞99%）、甲醇（MeOH，純度99.9%）和乙腈（ACN，純度99.9%）均購自SigmaAldrich公司；MilliQ純水（18 MΩ cm－1）純化自MilliQ系統（美國Millipore公司）；乙二胺四乙基（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、NH4Cl等為國產分析純試劑（國藥集團化學試劑有限公司）。

Flutide是長度為13個堿基的硫代修飾寡核苷酸（序列為5′CCTTGTTTCTACT3′），采用KTApilo Ⅱ核酸合成儀（美國GE Healthcare公司）進行合成，制備液相色譜純化，超濾脫鹽，旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥得到。縮短序列5′n－1 5′CTTGTTTCTACT3′、縮短序列3′n－1 5′CCTTGTTTCTAC3′和單氧代序列5′（P＝O）1 5′COCTTGTTTCTACT3′（序列中標有O的位置表示氧代）的合成和純化方法同上。

2.2 實驗方法

2.2.1 IPRPLC的色譜條件 2695液相色譜系統，996二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；分析柱為XTerra MSC18柱（250 mm× 4.6 mm，3.5

SymbolmA@ m，美國Waters公司）。樣品濃度為200

SymbolmA@ mol/L， 取10

SymbolmA@ L進樣。流動相A為142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA10%甲醇（V/V），流動相B為甲醇；梯度洗脫: 0～35 min， 0%～20% B; 35～37 min， 20%～0% B，平衡8 min；流速0.5 mL/min；柱溫50 ℃；檢測波長為260 nm。考察結果以分離度（R＝2（tR2－tR1）/（w1+w2））作為標準評價，其中， tR1和tR2分別代表前后兩個色譜峰的保留時間，w1和w2為各自的峰寬。

 分 析 化 學第39卷

第12期王 穎等： 離子對反相液相色譜法分析硫代寡核苷酸藥物流感泰得的有關物質 

2.2.2 IEC的色譜條件 600液相色譜系統，2487雙波長紫外可見檢測器（美國Waters公司）; 分析柱為DNAPac PA100柱（250 mm×4 mm，5

SymbolmA@ m，美國Dionex公司）；流動相A為1 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris10%乙腈（V/V），流動相B為1 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris3.0 mol/L NH4Cl10%乙腈（V/V）；梯度洗脫：0～30 min，10%～70% B；30～31 min，70%～100% B；31～36 min，100% B；36～41 min，100%～10% B。流動相均用MillQ水配制并用0.45

SymbolmA@ m濾膜過濾；流速為1 mL/min。柱溫50 ℃；檢測波長為260 nm；分析軟件為Millenium32。

2.2.3 CGE的分析條件 P/ACE MDQ毛細管電泳系統（美國Beckman公司）；eCAPTM DNA毛細管、eCAPTM ssDNA 100R膠，Tris硼酸和尿素緩沖液干粉。緩沖溶液為Tris硼酸7 mol/L尿素，pH 8.5；分離膠為250 g/L ssDNA 100R凝膠，分離電壓為－15.5 kV；分離溫度為40 ℃；采用電動進樣，進樣電壓－10 kV；檢測波長為254 nm；分析軟件為Beckman P/ACE system MDQ version 2.3。

2.2.4 ESIMS的分析條件 質譜采用TSQ7000電噴霧質譜儀（美國Thermo公司），操作系統為Xcalibur，采用美國Agilent HPLC1100分離，樣品經反相C18柱脫鹽后，取100

SymbolmA@ L直接進樣分析；毛細管電壓3.5 kV; 射頻透鏡電壓0.5 V;離子源溫度分別為180 ℃；離子源內真空度4.6×0－6 Pa，注射泵的流速為2

SymbolmA@ L/min， 采用負離子掃描模式，掃描范圍500～3000 U；數據分析軟件為Promass。

3 結果與討論

3.1 IPRPLC分析條件的建立和優化

3.1.1 流動相優化 作為實際藥物使用的單鏈寡核苷酸多由不同堿基排列組合而成的序列，因堿基組成不同帶來的樣品特殊性給分析和質量控制增加了難度[10]。IPRPLC法的分離主要基于不同長度寡核苷酸的帶電量和疏水性。最常用的離子對試劑為醋酸三乙胺（TEAA），然而TEAA對于長度大于25 mer的序列，分離全長序列（n）和失去一個堿基的縮短序列（n－1）效果較差[11]，并且由于硫代修飾后產生數個手性中心，導致峰展寬嚴重，因此該試劑主要用于未修飾的寡核苷酸。此外，TEAA和質譜聯用時還容易產生離子抑制[12]，不適用于后續的質譜鑒定分析。2001年， Apffer等[13]提出的HFIP能消除非對應異構體的影響，且與質譜兼容性好，離子化效率高，HFIPTEA離子對試劑已成功運用于LCMS聯用分析寡核苷酸及其代謝產物[14]。

本實驗選用XTerra MS C18柱，考察了不同濃度HFIPTEA離子對試劑條件下Flutide的5′n－1， 3′n－1雜質與n的分離度。研究發現， HFIP濃度在100～142 mmol/L范圍內、提高TEA的濃度時，3種化合物之間的分離度均有提高。然而，繼續增加HFIP和TEA的比例時，分離度反而下降。當HFIP濃度為142 mmol/L，加入36或43 mmol/L的TEA時，分離度最好，但后者在流動相配制時，TEA很難完全溶解，需攪拌很長時間，同時pH值升高。本實驗最終選擇142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA作為流動相，具體分析結果見表1和圖1。

同時還考察了相應濃度下5′n－1與5′（P＝O）1及n之間的分離度。發現HFIP在低濃度時，隨著TEA濃度的升高，三者之間的分離度增加，142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA時達到最大，R5′n－1， n＝1.72，R5′n－1， 5′（P＝O）1＝0.63，R5′（P＝O）1， n＝0.94；繼續增加HFIP和TEA的濃度，三者分離度均下降（圖2）。由于不

SymbolmA@ m）進行了比較，考察填料種類、分離效率及0.5 mL/min流速下的柱反壓。結果表明，XTerra MS C18柱和XBridge OST C18柱具有相似的保留能力，但后者具有更好的穩定性和重現性，并且柱長較短，相同柱效下梯度洗脫時間短，有效縮短了分析時間，但其缺點是價格較高，因此本研究選取XTerra MS C18柱用于Flutide常規的質量控制。

3.2 IPRPLC與IEC，CGE分析方法之間的比較

對基于不同分離原理的3種方法進行了比較，考察了Flutide（n）分別添加縮短序列以及添加硫代不完全序列的分離效果（圖3）。研究證明，IEC法能較好分離硫代不完全雜質5′（P＝O）1，但對n－1的分離度較差；CGE法無法分離全長序列n和硫代不完全雜質（P＝O）x，能與n－1進行分離，但無法分離3′n－1和5′n－1； IPRPLC法可將Flutide全長序列n與n－1和5′（P＝O）1兩類雜質同時實現分離，且能區分開3′n－1和5′n－1，因此該方法更適合于復雜雜質的分離鑒定。

3.3 IPRPLC方法在Flutide雜質分析中的應用

IPRPLC法能夠很好分離Flutide粗品和純品中各縮短序列雜質，測得粗品純度為86.84%（圖4a），純品純度為98.06%（圖4b）。其中，主要雜質5′n－1能夠與主峰完全分離，5′（P＝O）1與主峰實現部分分離。對Flutide粗品和純品進行了ESIMS分析（表3），結果表明， Flutide粗品IPRPLC分析圖譜中最靠近主峰的兩個主要雜質被確認為5′n－1和5′（P＝O）1，其中5′n－1分子量測定結果為3753.9（理論值為3754.1），5′（P＝O）1分子量測定為4043.2（理論值為4043.4）。Flutide純品IPRPLC圖譜中最靠近主峰的主要雜質被確認為5′n－1。

3.4 小結

本研究所建立的IPRPLC法能很好地分離硫代寡核苷酸全長和n－x序列，同時能部分分離出5′（P＝O）1雜質，檢測專屬性更高，優于IEC和CGE兩種方法，因此單獨應用IPRPLC即可對這兩類雜質進行分析，而通常需要IEC和CGE聯合分析才能達到該目的，簡化了分析步驟。此外，本方法還能彌補CGE重現性差的缺點，同時避免了IEC采用高鹽流動相帶來的不便，能夠更好地應用于Flutide的質量控制。

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17 Gilar M， Neue U D. J. Chromatogr. A， 2007， 1169（12）: 139～150



An IonPair Reversed Phase Liquid Chromatographic Method for

Analysis of Related Substances in Phosphorothioate

Antisense Oligonucleotide Flutide



WANG Ying1，2， LU DanDan2， ZHANG YuLin2， GAO Chan2， LI Shu2， WANG ShengQi*2



1（Anhui Medical University， Hefei 230032）

2（Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Science， Beijing 100850）



Abstract An ionpair reversed phase LC method （IPRPLC） was developed for the analysis of related substances of a phosphorothioate antisense oligonucleotide flutide and routine quality control. The analytical result of IPRPLC was compared with ion exchange chromatography （IEC） and capillary gel electrophoresis （CGE）. The synthesized flutide and its analogs of monphosphodiester 5′（P＝O）1 as well as deletion sequences 5′n－1 and 3′n－1 were analyzed. The optimized conditions of IPRPLC were as follows: XTerra MS C18 （250 mm × 4.6 mm， 3.5

SymbolmA@ m） column; the mobile phase A was 142 mmol/L 1，1，1，3，3，3hexafluoroisopropanol （HFIP）36 mmol/L triethylamine acetate （TEA）10% methanol （V/V）， the mobile phase B was methanol; the gradient from 0 to 20% of solution B in 35 min， then back to 0% in 2 min， equilibrated 8 min; column temperature: 50 ℃; flow rate of mobile phase: 0.5 mL/min; detection wavelength: 260 nm. The result showed that under these conditions， flutide， deletion sequences 5′n－1 and 3′n－1 could be completely separated from each other and the resolution R of flutide and 5′（P＝O）1 could reach to 0.94. The proposed IPRPLC method has been applied for the related substances analysis and identification of crude and purified flutide samples， indicating that this method can be used for the quality control of phosphorothioate antisense oligonucleotide.

Keywords Ionpair reversed phase liquid chromatography; Phosphorothioate oligonucleotides; Flutide; Quality control; Related substance analysis

（Received 18 April 2011; accepted 15 June 2011）