乳膠凝集法快速檢測豬圓環病毒2型

摘要 發展了一種簡單、快速、靈敏的乳膠凝集法用于豬圓環病毒2型的檢測。合成了帶有磺酸基的三元聚合物乳膠微球，通過靜電相互作用，將豬圓環病毒2型單克隆抗體吸附到乳膠微球表面，形成乳膠抗體復合物診斷試劑。乳膠抗體復合物診斷試劑表面抗體與病毒表面抗原發生特異性反應，促使分散的乳膠微球凝集在一起，出現肉眼可見的凝集現象，而與去離子水、磷酸鹽緩沖液、豬圓環病毒1型、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒、豬細小病毒、豬傳染性胃腸炎病毒不出現凝集現象。在最優化條件下，病毒濃度檢測范圍為3.1×10⁵～8.00×10⁷ copy/mL，檢出限為1.0 × 10⁵ copy/mL。采用本方法與PCR方法檢測了34份臨床血清樣本，結果的符合率達到94.1%，敏感性為89.5%，特異性達到了100%。結果表明，本方法可用于臨床血清樣品的檢測，在豬圓環病毒2型的檢測中表現出良好的應用前景。

關鍵詞 豬圓環病毒2型； 單克隆抗體； 乳膠凝集

2010-10-09收稿；2011-03-13接受

本文系國家自然科學基金（No.20975042）、華中農業大學自主科技創新重大培育專項基金（No.2010 PY 009）、國家大學生創新實驗計劃（No.091050426）資助

E-mail: hyhan@mail.hzau.edu.cn

1 引言

動物疾病不僅會造成巨大的經濟損失，而且會威脅人類的健康。豬圓環病毒（PCV）屬于圓環病毒，是一種小的無囊膜的單鏈環狀DNA病毒，DNA大小為1.76 kb，平均直徑約17 nm，是已知的最小的動物病毒之一^［1］。PCV根據其基因組和抗原性分為兩種類型：豬圓環病毒1型（PCV1）和2型（PCV2）^［2］。實驗證明，PCV1對豬沒有危害，而PCV2是斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥、豬呼吸道病綜合癥、豬皮炎腎病綜合癥的病原^［3，4］。在2008年第二十屆世界豬病大會上，PCV相關的疾病被列為危害養豬業的頭號疾病。目前，PCV相關疾病的診斷是通過檢測PCV2的抗體實現的，使用的方法有酶聯免疫法、間接免疫熒光法、免疫過氧化物酶單層試驗、膠體金免疫層析法等^［5～7］。然而，動物是否患病可以更直接通過檢測病毒判斷^［8］。常用的檢測PCV2的方法有聚合酶鏈式反應（PCR）技術、病毒分離技術、原位雜交技術、免疫組化法及免疫熒光技術^［9，10］。但是這些方法目前僅限于實驗室操作，需要專業技術，存在檢測成本高、費時、易出現假陽性等缺點，難以大范圍推廣。因此發展一種簡便、快速的新方法對早期檢測PCV2具有重要意義。

乳膠凝集試驗（Latex agglutination test， LAT）具有獨特優點：不需要特殊儀器、肉眼判斷、操作簡便、不需要專門培訓；檢測時間短，一般為2 min；價格低廉，檢測單份血清樣品的成本比其它血清學和病原學方法低得多；適于現場檢測等，在臨床檢驗中被廣泛應用^［11］。普通聚苯乙烯乳膠和抗體的結合是無選擇性的物理靜電吸附，抗體很難結合到乳膠表面，即使致敏上的抗體也容易從乳膠微球上脫落或者變性失活，而使用多肽縮合劑或交聯劑則操作過程繁瑣、耗時^［12］。為此，本實驗以帶有磺酸基的三元聚合物乳膠微球為載體，獲得單分散性好的乳膠，通過調節pH值后乳膠微球表面帶有較多的電荷，易吸附抗體。將單克隆抗體吸附到乳膠表面，制備乳膠抗體復合物診斷試劑。這種方法克服了普通乳膠致敏抗體的缺點，不需使用交聯劑，提高了抗體的結合效率，而且致敏上的抗體不容易從乳膠上脫落，進而提高乳膠的敏感性和保質期，適合產品開發和大規模生產的要求。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料LDZ4-0.8型低速平衡微型離心機（北京醫用離心機廠）。

豬圓環病毒2型單克隆抗體、臨床血清樣本（華中農業大學動物科學技術學院提供），苯乙烯（ST）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）、甲基丙烯酸丙基磺酸鉀（SPMAP）、NH₄HCO₃、（NH₄）₂S₂O₈，（分析純，上海國藥集團），磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7.4），其它試劑均為分析純， 實驗用水均為超純水。

豬圓環病毒2型毒株（PCV2）、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒毒株（PRRSV）、豬細小病毒毒株（PPV）、豬傳染性胃腸炎病毒毒株（TGEV）均由華中農業大學動物科學技術學院提供。

2.2 實驗方法

2.2.1 苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸丙基磺酸鉀（ST-MMA-SPMAP）乳膠的制備

參考文獻［13］的方法，并進行改進。ST和MMA使用前減壓蒸餾，除去阻聚劑。取14.10 mL ST、0.78 mL MMA、100 mL去離子水于250 mL三口瓶中，混合均勻，通氮氣保護。待瓶中液體溫度升至70℃時，將第一批混合液（0.438 g （NH₄）₂S₂O₈， 0.3 g NH₄HCO₃， 0.1 g SPMAP， 10 mL H₂O）快速加入瓶中，在70℃ 聚合4 h后，加入第二批混合液（2.81 mL St， 0.16 mL MMA， 0.5 g SPMAP， 0.1 g NH₄HCO₃， 10 mL H₂O ），再聚合6 h。

2.2.2 乳膠抗體復合物診斷試劑的制備

取制備好的乳膠，以10000 r/min離心10 min，去掉上清液，用PBS重懸沉淀物至原體積的10倍；加入適量PCV2單克隆抗體，室溫下孵育一定的時間，形成乳膠抗體復合物診斷試劑。制備好的乳膠呈現出均一的乳白色，圖1為本實驗方法合成的乳膠微球透射電鏡圖，可見乳膠微球粒徑均勻且分散性很好，粒徑約為160 nm。

2.2.3 LAT操作程序和結果的判定

乳膠抗體復合物診斷試劑與待檢血清中特異性抗原（即PCV2）相遇時，PCV2與乳膠微球表面抗體特異性結合，促使分散的乳膠微球凝集在一起，在玻片上形成肉眼明顯可見的乳膠微球凝集塊，即為陽性反應，如仍為均勻混濁的乳狀懸液，則為陰性反應。具體操作步驟：在一塊潔凈載玻片上加一滴乳膠抗體復合物診斷試劑，再加一滴待檢血清，用竹簽迅速攪動混勻，在3～5 min內判定結果，5 min后的結果不作為判定依據。其凝集強度大致可分為以下幾種:“＋＋＋＋”大量乳膠凝集，即100%凝集，顆粒聚于液滴的邊緣，中間呈透明狀；“＋＋＋” 顆粒明顯，液體幾乎全透明，約75%乳膠凝集；“＋＋” 顆粒較小，約50%乳膠凝集；“＋”液體呈渾濁，有較少的細小顆粒，約25%凝集；“－”液滴呈原有的均勻乳狀，未凝集。

臨床診斷時，陰性血清對照為“－”，以出現“＋＋”者判為血清陽性，出現一個“＋”號者判為可疑，對可疑的血清可進一步用PCR方法進行驗證。

3 結果與討論

3.1 乳膠偶聯抗體條件的優化

3.1.1 最佳偶聯抗體量的選擇

將單克隆抗體（濃度為2.65 g/L）用PBS倍比稀釋（1∶1， 1∶2， 1∶4和1∶8），

在稀釋好的乳膠中，各加入10 μL不同濃度的單克隆抗體（抗體的加入量分別為26.5， 13.3， 6.6和3.3 μg），室溫下反應1 h。反應完后與PCV2反應，觀察凝集現象，結果見表1。實驗表明，當抗體稀釋2倍，即加入量為13.3 μg時，偶聯效果最佳。

3.2.2 最佳偶聯時間的選擇

在稀釋好的乳膠中，加入10 μL一定濃度的單克隆抗體，在室溫下反應不同時間，反應完后與PCV2反應，觀察凝集現象，結果見表2。實驗表明，偶聯時間為75 min時，偶聯效果最佳。

3.2 乳膠抗體復合物診斷試劑自凝檢測

致敏好的乳膠抗體復合物診斷試劑同等量去離子水和PBS反應，沒有觀察到凝集現象，證明乳膠抗體復合物診斷試劑性質穩定，不會發生自凝反應。

3.3 LAT檢測結果

致敏好的乳膠抗體復合物診斷試劑不發生自凝現象，對待檢病毒進行LAT檢測，結果見圖2。乳膠抗體復合物診斷試劑與陽性血清反應呈現出明顯的肉眼可見的凝集現象，與陰性血清不反應，仍呈現出原有的均一乳白色。

A. 乳膠抗體復合物診斷試劑與陰性血清反應結果; B. 乳膠抗體復合物診斷試劑與陽性血清反應結果。A. Results of latex-antibody diagnostic reagent reacted with negative serum; B. Results of latex-antibody diagnostic reagent reacted with positive serum.

3.4 敏感性實驗和特異性實驗

將8×10⁷copy/mL PCV2依次稀釋2， 4， 8， 16， 32， 64， 128， 256和512倍，分別用乳膠抗體復合物診斷試劑檢測，結果見表3。實驗表明，乳膠抗體復合物診斷試劑的敏感性較強，能與256倍稀釋（濃度為3.1×10⁵ copy/mL）的PCV2發生反應。

乳膠抗體復合物診斷試劑與PCV2反應呈陽性，與PCV1， PRRSV， PPV和TGEV等反應均無凝集現象，特異性很好。

3.5 臨床血清樣本檢測結果PCR是公認的檢測PCV2的標準方法，因此對34份臨床血清樣本分別進行LAT和PCR檢測。如表4所示，本方法與PCR的符合率達到了94.1%（17＋15/34），敏感性為89.5%（17/19），特異性達到了100%（15/15），假陽性率為0（0/15），假陰性率也在合理的范圍內10.5%（2/19）。

實驗結果表明，與PCR相比，本方法在實際應用方面具有顯著的優勢：靈敏度高、特異性強、檢測成本低、操作簡便、快速、結果穩定。同其它檢測方法相比，本方法不需要專業技術，檢測耗時短，更適用于PCV2的早期診斷和大規模的臨床檢測，對減少養豬業的損失意義重大。

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Rapid Detection of Porcine Circovirus Type 2 by Latex Agglutination Test

ZHANG Hui-Min， YANG Li， LI Guang-Liang， WANG Lin， SEHNG Zong-Hai， HAN He-You^*

（College of Science， State Key Laboratory of Agricultural Microbiology，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Abstract A facile， rapid， ultrasensitive and visual method was developed for the determination of porcine circovirus type 2 （PCV2） based on latex agglutination test. Ternary polymer latex particles with sulfonic acid group were synthesized， then the monoclonal antibody of PCV2 bound to latex particles by electrostatic interactions and generated latex-antibody compound. The specific reaction of monoclonal antibody and virus showed visible agglutination phenomenon in the presence of a certain concentration of virus. Latex-antibody compound didn′t react with deionized water， phosphoric acid buffer， porcine circovirus type 1， porcine reproductive and respiratory syndrome virus， porcine parvovirus and porcine transmissible gastroenteritis virus. Under the optimized experimental conditions， the detection range of PCV2 was from 3.1×10⁵ copy/mL to 8.0×10⁷ copy/mL， and the detection limit was 1.0×10⁵ copy/mL. Compared with PCR， the proposed method has good efficiency （94.1%）， sensitivity （89.5%） and specificity （100%） in 34 serum samples analysis.

Keywords Porcine circovirus type 2; Monoclonal antibody; Latex agglutination

（Received 9 October 2010; accepted 13 March 2011）