葡萄糖檢測用分子印跡光子晶體的研究

摘要 基于快速、持續、無創檢測技術在血糖監測領域的重要性，以聚甲基丙烯酸甲酯微球陣列為光子晶體制孔模板，以葡萄糖為印跡模板，N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羥乙酯為混合單體，4-乙烯基苯硼酸為識別基，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，在制孔模板間隙進行共價型分子印跡聚合，除去制孔模板后，制得具有規整孔結構的新型光學凝膠材料——分子印跡光子晶體。實驗表明：此材料對葡萄糖響應速度快，選擇性高，印跡聚合物對葡萄糖吸附量在3 min即達到3.2 mg/g。在同等條件下，印跡聚合物對葡萄糖的吸附量是其它類似物吸附量的2倍以上。印跡聚合物的識別行為以衍射光波長變化形式表現，隨著葡萄糖濃度由0 mol/L增加到0.02 mol/L，葡萄糖分子印跡光子晶體的衍射波長發生150 nm的紅移，表現出良好的傳感特性。此材料為葡萄糖檢測提供了新思路，有望用于人體淚液或尿液中葡萄糖濃度的檢測，實現非侵入式的檢測手段。

關鍵詞 光子晶體；分子印跡；葡萄糖檢測；自組裝

2010-11-10收稿；2011-03-09接受

本文系國家自然科學基金（No.20775007），863計劃（No.2007AA10Z433）和環境毒理國家重點實驗室開放基金（No.KF2009-08）資助

* E-mail: m_zihui@yahoo.com

1 引言

糖尿病患病已成為威脅人類健康的疾病之一。實時快速監測糖尿病人的血糖對控制病情非常重要^［1］。病人對目前普遍采用的有創測試多有恐懼和不適，而且費用高。無創葡萄糖檢測可以很好地克服該缺點。因此，制備快速、持續、無創的傳感檢測技術是葡萄糖傳感器的發展方向之一^［2］。

光子晶體是一種新興的光學材料，正越來越多地應用于分析化學領域，有可能成為新的研究熱點^［3］。功能化的光子晶體在吸收目標化合物后， 晶體結構會發生變化， 從而會引起衍射波長發生改變，這便是光子晶體傳感器的檢測原理^［4］。其應用涉及對生化物質、毒劑、金屬離子及環境污染物等的檢測。將高度有序的帶電膠體晶體陣列包埋在水凝膠聚合物中，形成聚合膠體晶體陣列，可制備對葡萄糖^［5］、pH值^［6］、離子強度^［7］、金屬離子^［8］及生物分子^［9］等的傳感器。Nakayama等^［10］采用N-異丙基丙烯酰胺為單體，3-丙烯酰胺基苯硼酸為葡萄糖識別基，制備出一種簡便式葡萄糖光子晶體傳感器；張擁軍等^［11］將硼酸根修飾的聚N-異丙基丙烯酰胺微球包埋在凝膠中，構建了一種光強響應型葡萄糖傳感器。但是上述的方法都存在著選擇性差的缺點。Li等將分子印跡技術引入到光子晶體的骨架結構中，所制備的光子晶體凝膠能對蛋白質^［12］、茶堿和麻黃堿^［13］、莠去津^［14］和膽酸^［15］等目標分子進行快速特異性的識別，這種分子印跡光子晶體方法為光子晶體材料選擇性的提高開拓了全新的思路，擴大了分子印跡光子晶體傳感器的應用范圍。

分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers，MIP）具有與模板分子在空間結構和官能團上互補的孔穴，從而實現對目標化合物的選擇性識別。本研究將光子晶體與分子印跡相結合，以聚甲基丙烯酸甲酯微球自組裝光子晶體模板，在光子晶體模板間隙進行葡萄糖分子印跡聚合，洗脫小球模板和葡萄糖分子，制備出葡萄糖分子印跡光子晶體凝膠（Molecularly imprinted photonic crystal， MIPC）。MIPC對葡萄糖識別后發生溶脹，衍射峰發生明顯紅移。結果表明，葡萄糖MIPC是一種響應速度快、選擇性高的光子晶體凝膠材料。常規的血糖儀和血糖檢測方法都需要采血，給被檢測人帶來疼痛感，而且一次性耗材的使用使得家用血糖監控成本偏高，不利于推廣。葡萄糖MIPC凝膠的高選擇性和快速響應有望用于人體淚液或尿液中葡萄糖濃度的檢測，實現非侵入式的檢測手段，以期為糖尿病的家庭防治提供新技術。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑S-4800掃描電鏡（日本日立公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；ELSD-UM3000蒸發光散射檢測器（通微分析技術有限公司）；SiO₂正相色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm，Agela公司）；Avaspec-2048TEC微型光纖光譜儀（Avantes公司），配AvaLight-DH-S-BAL光源，FC-UV600-2-SR光纖 ；RW20數字攪拌器和C-MAG HS7控溫儀（IKA 公司）；KSW-5-12A型馬弗爐（天津市中環實驗電爐有限公司）；HWS-ISO生化培養箱和HWS-ISO恒溫恒濕箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）。

甲基丙基酸甲酯（MMA）、偶氮二異庚腈（ABVN）、N-異丙基丙烯酰胺（NIPA）、4-乙烯基苯硼酸（4-VPBA）均購自百靈威公司；過硫酸鉀（KPS）、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、H₂SO₄和H₂O₂（北京韋斯化學試劑公司）；N，N-亞甲基二丙烯酰胺（BIS）、二甲亞砜（DMSO）、丙酮、氨水、HCl、偶氮二異庚腈（ABDV，上海試思赫維化工有限公司）；甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA，阿拉丁試劑）；葡萄糖、D-核糖、L-鼠李糖均購自中北格林試劑公司。以上試劑均為分析純。乙腈（色譜純，Fisher公司），超純水由AWL-0502-U超純水系統（艾科浦公司）制備。

2.2 實驗方法

2.2.1 葡萄糖分子印跡聚合物（MIP）的制備及吸附性能檢測 稱取葡萄糖0.0307 g（0.17 mmol）， 識別基4-VPBA 0.0252 g （0.17 mmol）， 功能單體HEMA 1.5 mL （12.4 mmol）， NIPA 0.1698 g （1.5 mmol）， 交聯劑BIS 0.0490 g（0.32 mmol）， 引發劑ABVN 0.0064 g （0.03 mmol），溶于1.5 mL純水和0.4 mL DMSO的混合溶劑中，超聲至全部溶解，并充氮除氧，得到分子印跡預聚合溶液。在60 ℃下熱聚12 h。將合成的聚合物于60 ℃的真空干燥箱中干燥，研磨為均勻的細小顆粒備用。

色譜條件：SiO₂正相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），蒸發光散射檢測器，進樣量20 μL，室溫，流動相為乙腈-水（2∶1，V/V），流速1.0 mL/min。

2.2.2 單分散聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）膠體微球的制備與自組裝 將30 mL MMA和255 mL去離子水置于1000 mL四口燒瓶中，以300 r/min不斷攪拌，氮氣保護下加熱至80 ℃，快速加入0.04 g/mL KPS溶液，繼續恒溫攪拌45 min。反應結束后，引發劑、未反應的單體等通過離心的方法除去，再用去離子水重新超聲分散、離心，再分散進行膠體微球的純化過程，重復 3 次后將所制得的PMMA膠體微球分散在去離子水中進行保存。

通過垂直沉降法^［16］將PMMA微球自組裝在玻璃基片上。以蓋玻片為基片，用去離子水清洗干凈，吹干，浸泡到濃H₂SO₄-H₂O₂（7∶3， V/V）溶液中12 h， 進行親水化處理。用去離子水清洗多次后吹干。將處理過的基片垂直貼于玻璃槽內，加入0.3%（m/m）PMMA微球懸浮液，在30 ℃，濕度50%的條件下于恒溫恒濕培養箱中控制溶液勻速揮發，小球通過表面張力慢慢自組裝于基片上。

2.2.3 葡萄糖分子印跡光子晶體的制備 MIPC膜的制備過程如圖解1所示。在PMMA膠體晶體模板邊緣慢慢滴加MIP預聚溶液，通過溶液的虹吸擴散作用使溶液布滿整個膜片。將膜片于60 ℃下熱聚合12 h。聚合后，膜片先用丙酮浸洗7 h，除去PMMA小球模板，再按1%氨水、純水、HCl-純水（pH 4）的順序清洗3次，除去印跡模板葡萄糖分子，得到分子印跡光子晶體膜片（MIPC）。膜片最后浸泡于去純水中平衡，準備測量其光學性能。制備空白聚合物（Non-imprinted polymers，NIP）時，除不加模板分子外，其它方法同上。

2.2.4 葡萄糖印跡光子晶體的傳感特性

用微型光纖光譜儀測試薄膜的布拉格衍射光譜。10 mL含0.15 mo/L NaCl緩沖溶液（pH 9.6）在37 ℃恒溫水浴中恒溫，分別放入MIPC膜和非印跡膜（NIPC），檢測其衍射波長。記錄后逐次加入葡萄糖，使溶液中葡萄糖濃度分別為0.001，0.005，0.010，0.015和0.020 mol/L，記錄每次加入葡萄糖后MIPC膜衍射峰紅移后的位置。

3 結果與討論

3.1 葡萄糖分子印跡聚合物的制備

硼酸是一種常用的葡萄糖識別基，苯硼酸衍生物作為一種共價型單體被廣泛用于葡萄糖分子印跡聚合物的制備^［17］。Nakayama等^［10］的研究表明，在溶液中苯硼酸處于解離平衡中，解離狀態的苯硼酸能與葡萄糖分子結合形成酯，與葡萄糖分子的結合，促使苯硼酸平衡向解離方向移動。

本研究以4-乙烯基苯硼酸（4-VPBA）為葡萄糖的識別基，如圖解2所示，用于聚合的乙烯基和體系中的交聯劑相連接，葡萄糖上鄰位二醇與四乙烯基苯硼酸之間形成酯鍵，這一聯結點的生成和分解都是較快和較易進行的。聯結點具有穩定的剛性五元環結構，有效實現了分子印跡。在聚合后，酯鍵可以通過水解斷裂，而硼酸基就能適當地排布于聚合體內，以鍵合客體分子。

印跡模板分子、識別基、功能單體和交聯劑的物質的量之比為1∶1∶81.8∶1.5。此比例所得到的印跡聚合物柔韌性較好，為透明狀聚合物，易于制備膜狀MIPC。

3.2 MIP的印跡效果評價

通過印跡過程，聚合物骨架上不僅有4-VPBA識別基，還有與葡萄糖立體結構相匹配的空間結構。因此，MIP對葡萄糖的特異性識別能力比NIP更強。MIP在弱堿性條件下呈現一定的表觀印跡效果，與4-VPBA識別機理相同（圖解2）。實驗表明，在pH＝9.6情況下，MIP印跡效果明顯，且響應時間也很快，在3 min 內即達到飽和，符合傳感器快速響應的要求（圖1）。但是在生理條件（37 ℃，pH＝7.4）下，pH值偏低，淚液和尿液中的pH值變化范圍較大，限制了MIPC的應用。

3.3 MIP選擇性的評價

選擇與葡萄糖結構相似的D-核糖和L-鼠李糖進行色譜吸附實驗，以判定MIP和NIP對葡萄糖的選擇性。

表1中所列的吸附數據的吸附時間均為6 min。MIP對葡萄糖的吸附量分別是D-核糖 和L-鼠李糖吸附量的2.4倍和2.9倍。NIP對葡萄糖的吸附量低于MIP。說明在MIP中，模板分子的印跡效應發揮了作用，對葡萄糖表現出較高選擇性。

3.4 葡萄糖分子印跡光子晶體的制備

本研究中所制備的單分散PMMA微球單分散性好，平均粒徑為280 nm，通過垂直沉降法得到具有一定規整排列的光子晶體模板。洗脫掉PMMA微球和葡萄糖分子的去除，就形成具有高度有序大孔陣列結構的MIPC膜，能夠與葡萄糖分子進行特異性可逆共價結合。圖2為PMMA光子晶體模板以及葡萄糖印跡薄膜的掃描電鏡圖。制備好的小球模板需要加上聚合物溶液進行聚合，而溶液的加入很有可能破壞整齊排列的小球陣列。所以，需要對模板先進行固化處理。一般固化可通過高溫燒結的方法。將自組裝好的模板在200℃高溫下處理30s進行固化，使小球與小球間產生互相連接的“頸”，整個陣列具有良好的穩定性。相同條件下，固化后制備的光子晶體比未進行固化制備的光子晶體光學性能好。

3.5 葡萄糖印跡光子晶體的傳感特性

傳統的分子印跡聚合物只能提供大量的親合位點，這些親和位點可以作為傳感裝置的識別系統對目標分子進行特異性識別；然而，作為一個傳感單元，還需要某些信號轉換裝置將分子識別的化學過程轉換為可讀的信號。為了達到快速、簡便檢測的目的，在體系中引入了具有靈敏度高，信號易讀的光子晶體結構。三維有序的光子晶體結構可以與可見光相互作用產生布拉格衍射，也稱布拉格反射，同時分子識別的化學過程會影響到光子晶體凝膠的晶格參數，對衍射峰的位置進行調解，因此分子識別的過程可以直接轉化為可讀的光信號。

分子印跡光子晶體凝膠的衍射峰的位置由布拉格衍射方程（1）

其中，m是衍射級數，λ是發生衍射的光的波長，n是三維陣列的平均折光指數，d是晶面間距，θ是入射光與晶面法線的夾角。當θ一定時，λ正比于d，即晶格間距的任何變化都會引起布拉格衍射峰的移動。

通過衍射方程可以推斷，如果分子識別過程能夠引起凝膠的溶脹或收縮，光學信號就可以被觀察到。

測試了葡萄糖分子印跡光子晶體凝膠薄膜的傳感特性。將薄膜放置在一系列濃度的葡萄糖溶液中，待達到平衡后記錄布拉格衍射峰的位置。為了進一步闡明印跡膜的選擇特性，將印跡膜和非印跡膜分別浸入葡萄糖的不同濃度的溶液中，得到圖3的光譜圖。MIPC凝膠由于具有分子印跡產生的納米孔穴，特異性吸附葡萄糖分子后引起光子晶體結構的變化，進而導致了衍射峰發生紅移。隨著葡萄糖濃度的增加，MIPC膜和NIPC膜的衍射波長均發生紅移。葡萄糖濃度為0.02 mol/L時，MIPC膜的衍射波長紅移約150 nm，NIPC膜的位移量僅約為MIPC的1/3。圖3中縱坐標為反射率，即樣品的反射強度與儀器自帶的白色參考背景的反射強度的百分比，可以看出反射的強度并沒有明顯的變化規律。

本方法制備的分子印跡光子晶體膜靈敏度強，在不同葡萄糖濃度下位移明顯，符合傳感器的要求，可對葡萄糖進行快速、方便、準確的檢測。

[LM]

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Molecularly Imprinted Photonic Crystal for Detection of Glucose

XUE Fei， DUAN Ting-Rui， XUE Min， LIU Feng， WANG Yi-Fei， WEI Ze-Quan，WANG Miao， ZHANG Pan， YUAN Zi-Gao， MENG Zi-Hui^*

（School of Chemical Engineering and the Environment， Beijing Institute of Technology， Beijing 100081）

Abstract A three-dimensionally ordered， macroporous， inverse-opal glucose molecularly imprinted polymer crystal （MIPC） film was synthesized by the inverted colloidal-crystal template technique. Preparation of our MIPC was carried out by thermo-poymerization of monomers （2-hydroxyethyl methacrylate and N-isopropylacrylamide）， covalent recognizer （4-ethylenyl phenylboronic acid）， and cross-linker （N，N′-Methylenebisacrylamide） with poly（methyl-methacrylate） （PMMA） particle array as template， followed by chemical removal of the template using acetone. Due to its 3D-ordered macroporous arrays with molecular imprinting， nanocavities， the formed photonic hydrogel allows rapid and selective detection of the target glucose. The glucose adsorption amount of our MIP was 3.2 mg/g in 3 min which is two times more than that of other analogues. The diffraction wavelength of the MIPC redshifts was more than 150 nm in response to 0.02 mol/L of glucose. Our results revealed that MIPC could provide a novel non-invasive approach for glucose detection in tears or urine and exhibit a promising potential for development of new glucose monitoring technology.

Keywords Photonic crystals；molecular imprinting；Glucose detection；Self-assembly

（Received 10 November 2010accepted 9 March 2011）