氣相色譜-正化學源質譜法測定橡膠中N-亞硝胺及其前體物的遷移量

摘要 從樣品前處理和儀器分析方法兩方面對歐盟標準EN 12868:1999中N-亞硝胺及其前體物的測試方法進行了改進，使其更適合批量樣品的快速精確分析。用人工唾液浸泡橡膠制品，模擬其接觸人體過程中N-亞硝胺的析出過程，再用Sep-Pak AC2串聯Sep-Pak Dry固相萃取小柱對人工唾液中的N-亞硝胺分析物進行萃取凈化，最后用DB 624毛細管氣相色譜柱對其進行分離，正化學源質譜在全掃和單掃兩種模式下進行分析。7種N-亞硝胺在10～10000 μg/L濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數R均大于0.99； 對橡膠中N-亞硝胺及其前體物的方法檢出限分別為1.25和5.00 μg/kg，低于歐盟93/11/EEC的限量要求；3個加標水平1.25， 12.5和125 μg/kg的回收率分別為80.6%～95.5%， 86.8%～98.3%和92.2%～110.4%，RSD分別為4.2%～7.7%， 4.1%～5.8%和2.6%～4.3%（n＝6）。分析的氣球樣品中，7種N-亞硝胺及其前體物的總檢出含量分別為0.421～0.820 mg/kg和3.616～8.437 mg/kg，均超出歐盟93/11/EEC指令的限制要求；但分析的嬰兒奶嘴樣品中則均未有檢出N-亞硝胺及其前體物。

關鍵詞 氣相色譜-正化學源質譜法; 橡膠，N-亞硝胺; 前體物; 固相萃取

2010-11-17 收稿；2011-03-14接受

本文系廣東省質量技術監督局科技項目基金（No.2010CZ10）資助項目

E-mail: xingyn@smq.com.cn

1 引 言

N-亞硝胺是具有NNO官能團的一類有機化合物，N-亞硝胺前體物是指在酸性條件下可轉變成N-亞硝胺的硝酸鹽、亞硝酸鹽和胺類等。N-亞硝胺前體物既可通過化學途徑在環境中外源性合成，也可通過生物途徑在生物體內內源性合成多種N-亞硝胺化合物。1937年，Freund首次報道了2例職業接觸N-亞硝基二甲胺的中毒案例^［1］。目前，已發現的N-亞硝胺有300多種，大約90%已被證實具有致癌性^［2～4］。N-亞硝胺可通過呼吸道、消化道和皮膚吸收等途徑進入人體，將DNA烷基化，進而誘發癌癥。國際癌癥研究協會已初步確定了對人體具有致癌活性的7種揮發性N-亞硝胺^［5］：N-亞硝基二甲胺（NDMA），N-亞硝基二乙胺（NDEA），N-亞硝基二丙胺（NDPA），N-亞硝基二丁胺（NDBA），N-亞硝基嗎啉（NMOR），N-亞硝基吡咯烷（NPYR）和N-亞硝基哌啶（NPIP）。

在橡膠生產過程中，加入的硫化促進劑分解后會產生仲胺，而仲胺進一步與空氣或吸附劑中的氮氧化合物在酸性條件下生成穩定的N-亞硝胺，其反應式如下：

NH＋NO_XRRNRRNNO（1）

橡膠產品中的N-亞硝胺污染情況已引起歐盟地區的廣泛關注。1993年3月15日，歐盟官方發布了93/11/EEC指令，規定在彈性體或橡膠奶嘴和安撫奶嘴中N-亞硝胺及其前體物的遷移量分別不可超過10 和 100 μg/kg。此后，德國通過《德國商品法》限制橡膠氣球N-亞硝胺及其前體物的遷移量，分別不可超過50和1000 μg/kg，并規定可放入嘴的3歲以下兒童玩具中的N-亞硝胺及其前體物的遷移量必須滿足93/11/EEC指令中的相關規定。2009年，歐盟通過《玩具安全新指令》（2009/48/EC）， 進一步明確了兒童玩具中不可以含有N-亞硝胺化合物。

N-亞硝胺的分析方法包括氣相色譜質譜聯用法（GC-MS）^［4～6］、高效液相色譜法（HPLC）^［7～9］和氣相色譜熱能檢測器聯用法（GC-TEA）^{［10～12］}等。GC-MS法采用單級低分辨電子轟擊源（EI）質譜測定分析N-亞硝胺時，受基質干擾嚴重，難以對低分子量N-亞硝胺進行定性分析。HPLC法的紫外-可見光檢測器對N-亞硝胺特異性不強，為提高檢測靈敏度，通常需要對目標分析物進行衍生，操作繁瑣。相比前兩種方法，GC-TEA法受基質影響較小，對前處理要求不高，無需衍生就有很好的選擇性，是目前應用最廣泛的N-亞硝胺測定方法。但TEA只可用于含亞硝基化合物的檢測，專用性強，多數實驗室都未裝備，其應用受到嚴重限制。近年來，高分辨質譜（HRMS）^［13］和二級質譜（GC-MS/MS、HPLC-MS/MS）^{［14，15］}也被用于N-亞硝胺的分離鑒定，以提高對N-亞硝胺的定性能力和分析靈敏度。但由于儀器昂貴，應用并不普遍。

目前，國際上主要參照歐盟標準EN 12868:1999對橡膠制品中的N-亞硝胺進行測定^{［16，17］}。本研究從前處理方法和儀器分析方法兩方面對EN 12868：1999標準進行了優化，優化后的方法分析靈敏度高，且流程簡單，適用于批量樣品的快速精確處理。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

GC-PCI/MS聯用儀（Trace GC Ultra-DSQ II MS，美國賽默飛世爾科技有限公司）；固相萃取裝置（美國J. T. Baker公司）；Sep-Pak AC2固相萃取小柱、Sep-Pak Dry固相萃取小柱（美國Waters公司）；KS 4000i control恒溫振蕩搖床（德國IKA公司）；N-Evap 112氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates 公司）；超純水系統（Milli Q Biocel A10，法國Millipore公司）。

NDMA（≥96.0%）， NDEA（≥99.0%）， NDPA（≥98.0%）， NDBA（≥98.5%）， NMOR（≥99.0%）， NPYR（≥99.0%）和NPIP（≥99.0%）均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；NaHCO₃， NaCl， NaNO₂， Na₂CO₃， HCl， NaOH（分析純，廣州化學試劑廠）；二氯甲烷、甲醇（色譜純，美國Merk公司）；實驗用水經Milli-Q超純水系統過濾，電阻率為18.2 MΩ·cm。

3個氣球樣品和3個嬰兒奶嘴樣品均購自當地超市。

2.2 樣品前處理

2.2.1 人工唾液的配制 參照EN 12868標準配制：稱取4.2 g NaHCO₃， 0.5 g NaCl， 0.2 g Na₂CO₃和30 mg NaNO₂，以水溶解并稀釋至900 mL，調節至pH 9.0，再定容至1 L。

2.2.2 模擬人體遷移過程 參照EN 12868標準，模擬人體遷移過程，對氣球中的N-亞硝胺及其前體物進行萃取。將橡膠樣品剪成約1 cm×1 cm大小，稱取10 g（精確至0.001 g）樣品于50 mL的錐形瓶中，加入40 mL人工唾液后蓋上蓋子，于（40±2） ℃恒溫振蕩24 h。冷卻至室溫后，將錐形瓶中的浸泡液轉移至50 mL帶塞量筒內。用4 mL人工唾液洗滌樣品兩次，將洗滌液與前述浸泡液合并，用人工唾液定容至50 mL。搖勻后，轉移10 mL溶液至錐形瓶中，加入1 mL 1.0 mol/L HCl，混勻后避光反應30 min，再加入2 mL 1.0 mol/L NaOH，此為溶液B，用于N-亞硝胺前體物的測定；在剩余40 mL溶液中加入1 mL 1.0 mol/L NaOH，此為溶液A，用于N-亞硝胺的測定。整個樣品處理及分析過程均在避光條件下操作，防止N-亞硝胺光降解。

2.2.3 固相萃取凈化濃縮 Sep-Pak AC2固相萃取柱用6 mL二氯甲烷、6 mL甲醇和10 mL去離子水依次活化。溶液A（或溶液B）以小于5 mL/min的流速經過已經活化好的Sep-Pak AC2固相萃取柱。上樣完后，真空抽干30 min。將經過抽干處理的Sep-Pak AC2固相萃取柱與用4 mL二氯甲烷活化后的Sep-Pak Dry固相萃取柱串聯，最后用6 mL二氯甲烷洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮至1 mL。

2.3 儀器分析

2.3.1 色譜條件 采用DB-624毛細管柱（60 m×0.25 μm×1.40 μm）對目標分析物進行分析。起始柱溫為50 ℃，保留1 min；以20 ℃／min的速率升溫至200 ℃并保持3 min；以10 ℃／min的速率升溫至240 ℃并保持5 min。進樣口溫度為200 ℃；傳輸線接口溫度為240 ℃；進樣量為1 μL，采用不分流進樣，1 min后轉到分流模式（分流比20∶1）；載氣為高純氦氣，流速為1.2 mL/min。

2.3.2 質譜條件 采用化學電離源（PCI），離子源溫度為160 ℃；反應氣為甲烷，流速為2.5 mL/min；掃描模式為SIM和Full scan同時掃描；分析物的定量離子碎片為：NDMA （m/z 75），NDEA （m/z 103），NDPA （m/z 131），NDBA （m/z 159），NMOR （m/z 117），NPYR （m/z 101），NPIP （m/z 115）。

3 結果與討論

3.1 固相萃取小柱的選擇

在20 mL空白人工唾液中加入了N-亞硝胺混合物，使其添加濃度為0.5 μg/L。分別用3種商品化固相萃取小柱（Waters Oasis HLB、Varian Chem Elut和Waters Sep-Pak AC-2）對人工唾液中的N-亞硝胺目標分析物進行萃取。Waters Oasis HLB柱的萃取凈化流程：將加標人工唾液經過依次用甲醇、水活化的HLB柱，用5%甲醇淋洗，再用甲醇洗脫；Varian Chem Elut柱的萃取凈化流程：將加標人工唾液上樣后，平衡10 min，然后用二氯甲烷洗脫；Waters Sep-Pak AC-2柱的萃取凈化流程見2.2.3節。3種固相萃取柱從人工唾液中萃取N-亞硝胺化合物的回收率及相對標準偏差見表 1。結果表明，Waters Oasis HLB柱對N-亞硝胺無保留；Chem Elut柱對部分N-亞硝胺的保留較弱；而Waters Sep-Pak AC-2柱對7種N-亞硝胺化合物都能有較好的保留。因此，本研究選擇Waters Sep-Pak AC2柱對模擬遷移液中的N-亞硝胺進行萃取凈化。

表1 3種固相萃取小柱從人工唾液中萃取N-亞硝胺的回收率及相對標準偏差（n＝6）

Table 1 Recovery and RSD of N-nitrosamines extraction from artificial saliva with three different SPE columns （n＝6）

3.2 色譜柱的的選擇

本研究比較了非極性柱DB-5MS、中等極性柱DB-35MS和極性柱DB-624對目標分析物的分離效果。N-亞硝胺的強極性導致其在DB-5 MS和DB-35MS色譜柱上的分離效果不佳；DB-624是專門針對揮發性有機污染物分析而設計的色譜柱，填料為6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷共聚物，使7種目標N-亞硝胺獲得了較好的分離度（圖1）。

3.3 質譜電離源的選擇

由于揮發性N-亞硝胺的分子量比較小，用GC/EI-MS進行分析時，特征碎片離子不明顯，受背景干擾嚴重。因此，GC/EI-MS對N-亞硝胺化合物，尤其是NDMA的選擇性和響應都較差。CI源是一種軟化學電離源，其主要獲得準分子離子，一般少有碎片離子。與EI源相比，CI源背景干擾少，響應靈敏度高。由于N-亞硝胺類化合物具有堿性和親核的性質，本研究采用PCI源，以甲烷為反應氣對N-亞硝胺化合物進行分析。

3.4 工作曲線與檢出限

7種N-亞硝胺在10～10000 μg/L范圍內呈良好線性關系，相關系數R均大于0.99。以10倍信噪比計算，本方法對橡膠樣品中單個N-亞硝胺及其前體物的檢出限分別為1.25和5.00 μg/kg，遠低于歐盟93/11/EEC指令的限量要求。

3.5 方法的回收率與精密度

N-亞硝胺前體物涉及的化合物范圍很廣，包括硝酸鹽、亞硝酸鹽和胺類等，因此，無法對其回收率進行精確實驗測定，下述討論的內容只針對N-亞硝胺化合物進行討論。在陰性橡膠樣品中添加N-亞硝胺混合物，使其添加濃度分別為1.25， 12.5和125 μg/kg。按上述2.2和2.3節的方法進行回收率實驗，其回收率及精密度結果如表 2 所示。

表2 N-亞硝胺化合物的加標回收率和相對標準偏差（n＝6）

Table 2 Recovery and RSD （n＝6） of N-nitrosamines at three spiked concentration

3.6 實際樣品分析

從表3和表4可見，分析的氣球樣品中均含有N-亞硝胺及其前體物； 而嬰兒奶嘴樣品中7種N-亞硝胺及其前體物均未檢出。這主要是由于目前市面上賣的嬰兒奶嘴大都用液態硅膠為材質，避免含有N-亞硝胺，危害嬰兒身體健康。氣球是兒童常用的玩具之一，其中的N-亞硝胺污染情況不容忽視。德國現行規定要求氣球中的N-亞硝胺及其前體物的遷移量應分別低于0.05和1.0 mg/kg。與此標準相對照，本研究所分析的氣球樣品中N-亞硝胺及其前體物的遷移量偏高。這不僅影響國內兒童的身體健康，還將影響中國的對外出口貿易。2009年，中國出口的氣球連續兩周因N-亞硝胺及其前體物的遷移量超標被荷蘭召回^［18］。

表3 橡膠制品中N-亞硝胺的遷移量（mg/kg）

Table 3 Migration levels of N-nitrosamines from rubber products （mg/kg）

表4 橡膠制品中N-亞硝胺前體物的平衡遷移量（mg/kg）

Table 4 Migrationlevels of N-nitrosatable substances from rubber products （mg/kg）

3.7 對EN 12868:1999方法的改進

3.7.1 前處理方法的改進 N-亞硝胺的強親水性、強極性和強揮發性導致難以將其從水相中分離出來，無論是液液萃取還是固相萃取，均容易出現回收率差的情況^［4，5］。EN 12868:1999方法是先通過固相萃取法或液液萃取法對人工唾液中的N-亞硝胺進行凈化分離，再用K-D濃縮儀進行濃縮以有效避免揮發性有機物的濃縮損失。雖然硅藻土填料的固相萃取柱能使N-亞硝胺從水相體系中分離出來，但整個處理過程繁雜，需耗費大量有機溶劑，不利于批量樣品的快速處理。本方法是將模擬浸泡液直接通過活化好的Sep-Pak AC2固相萃取小柱對N-亞硝胺進行分離、凈化和初步濃縮。Sep-Pak AC2固相萃取小柱在將極性有機物從水相體系中進行分離富集方面性能優異，對N-亞硝胺進行凈化分離和富集具有很好的回收率和重現性；本方法大幅簡化了樣品前處理流程，可滿足檢測機構對批量樣品的快速處理要求；有機溶劑使用量的大幅減少，減輕了對環境的二次污染。

3.7.2 儀器分析方法的選擇 EN 12868:1999采用GC-TEA對N-亞硝胺進行分析。TEA檢測器是為檢測硝基或亞硝基化合物而特別設計的，其原理是含有N-亞硝基的化合物經過快速催化加熱器或裂解器時，NNO鍵斷裂，釋放出亞硝酰基（NO），然后亞硝酰基在一個反應器中被臭氧氧化為電子激發態的二氧化氮（NO₂*），激發態的二氧化氮衰變成原來狀態時發射出特征的輻射，發射的強度可用靈敏的光電倍增管檢測。由于GC-TEA對N-亞硝胺化合物的強選擇性和高靈敏，被眾多權威標準所采用^{［19～21］}。但TEA檢測器應用范圍狹窄，且造價昂貴，因此，EN 12868:1999方法的普適性差。本研究采用GC-PCI/MS對N-亞硝胺化合物進行測定分析。PCI源的采用一方面避免了GC-EI/MS測定背景干擾嚴重、響應差的問題；另一方面也避免了GC-TEA普適性差的問題，CI源和EI源是實驗室常見的兩種離子源，真空鎖定技術的應用，使真空條件下進行離子源更換非常方便。

References

1 Preussmann R. IARC Sci. Publ.， 1983， 45: 3～17

2 Rounbehler D P， Fajen J M. N-nitroso Compounds in the Factory Environment. Cincinnati， Ohio: U.S. Dept. of Health and Human Services， 1983: 195～204

3 International Agency for Research on Cancer （IARC）. IARC Monographs on the Evaluation of the Carcinogenic Risk to Humans， some N-nitroso Compounds. France， Lyon: International Agency for Research on Cancer， 1978， 17: 365

4 Taguchi V Y， Jenkins S W D， Wang D T， Palmentier J P F P， Reiner E J. Canadian Journal of Applied Spectroscopy， 1994， 39（3）: 87～93

5 Jenkins S W D， Koester C J， Taguchi V Y， Wang D T， Palmentier J P F P， Hong K P. Environ. Sci. Pollut. R.， 1995， 2（4）: 207～210

6 Raksit A， Johri S J. J. AOAC Int.， 2001， 84（5）: 1413～1419

7 Cardenes L， Ayala J H， Gonzalez V， Afonso A M. J. Chromatogr. A， 2002， 946（1-2）: 133～140

8 Cha W， Fox P， Nalinakumari B. Anal. Chim. Acta， 2006， 566（1）: 109～116

9 Kodamatani H， Yamazaki S， Saito K， Amponsaa-Karikari A， Kishikawa N， Kuroda N， Tomiyasu T， Komatsu Y. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（1）: 92～98

10 Byun M W， Ahn H J， Kim J H， Lee J W， Yook H S， Han S B. J. Chromatogr. A， 2004， 1054（1-2）: 403～407

11 Andrade R， Reyes F G R， Rath S. Food Chem.， 2005， 91（1）: 173～179

12 Feng D， Wang H P， Cheng X L， Wang J D， Ning L F， Zhou Q F， Zhou Y， Yang Q L. Int. J. Hyg. Environ. Health， 2009， 212: 533～540

13 Planas C， Palacios O， Ventura F， Rivera J， Caixach J. Talanta， 2008， 76（4）: 906～913

14 EPA/600/R-05/054. Method 521: Determination of Nitrosamines in Drinking Water by Solid Phase Extraction and Capillary Column Gas Chromatography with Large Volume Injection and Chemical Ionization Tandem Mass Spectrometry. Method of US Environmental Protection Agency

15 Zhao Y Y， Boyd J， Hrudey S E， Li X F. Environ. Sci. Technol.， 2006， 40（24）: 7636～7641

16 VWA， Report ND1TOY01/01-Migration of Nitrosamines and Nitrosatable Substances from Balloons， http://www.vwa.nl/txmpub/files/？p_file_id10483， 2002

17 VWA， Report nr. ND04o063/02-Migration of N-nitrosamines and N-nitrosatable Substances from Latex Balloons， http://www.vwa.nl/txmpub/files/？p_file_id10474， 2005

18 Europa， week 37 38-Weekly overview report of RAPEX notifications， http://ec.europa.eu/consumers/dyna/rapex/rapex_archives_en.cfm， 2009

19 EN 12868:1999， Child Use and Care Articles-Mehods for Determining the Release of N-nitrosamines and N-nitrosatable Substances from Elastomer or Rubber Teats and Soothers. The European Standards

20 GB/T5009.26-2003， Determination of N-nitrosamines in Foods （食品中N-亞硝胺類的測定）. National Standards of the People′s Republic of China（中華人民共和國國家標準）

21 GB/T 23228-2008， Cigarette-Determination of Tobacco Specific N-Nitrosamines in Total Particulate Matter of Mainstream Cigarette Smoke-GC-TEA Method（卷煙 主流煙氣總粒相物中煙草特有N-亞硝胺的測定 氣相色譜-熱能分析聯用法）. National Standards of the People′s Republic of China（中華人民共和國國家標準）

Determination of Migration Levels of N-Nitrosamines and

N-Nitrosatable Substances from Balloons by Gas Chromatography-

Positive Chemical Ionization Mass Spectrometry

XING Yuan-Na^*1， NI Hong-Gang²， WANG Xin¹， CHEN Ze-Yong¹， HUANG Jin-Min¹

¹（RD Department of Green Technology， Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection， Shenzhen 518109）

² （Shenzhen Key Laboratory for Circular Economic， Shenzhen Graduate School， Peking University， Shenzhen 518055）

Abstract For analysis of a bunch of samples， a rapid， selective， sensitive and precision method in EN 12868:1999 was developed to determine the release of N-nitrosamines and N-nitrosatable substances from elastomer or rubber teats and soothers in both of sample preparation and instrumental analysis. To imitate the migration of N-nitrosamines and N-nitrosatable substances from rubber balloons and teats to human body， rubber products studied in this research were soaked in artificial saliva. The target analytes released to artificial saliva were extracted by Sep-Pak AC2 connected to Sep-Pak Dry cartridges， and isolated by DB 624 GC column， and determined by positive chemical ionization mass spectrometry in both full scan and SIM mode. Linear concentration-response relationships were obtained in a calibration range from 10 to 1000 μg/L with high correlation（R＞0.99） for all target analytes. The method detection limits of each N-nitrosamines and N-nitrosatable substances released from rubber products were 1.25 and 5.00 μg/kg， respectively， which are much lower than the requirement of Directive 93/11/EEC （N-nitrosamines: 10 μg/kg; N-nitrosatable substances: 100 μg/kg）. The average spike recoveries ranged from 80.6% to 95.5% （RSD 4.2%－7.7%， n ＝6）， from 86.8% to 98.3% （RSD 4.1%－5.8%， n＝6）， and from 92.2% to 110.4% （RSD 2.6%－4.3%， n＝6） for the spiked levels of 1.25， 12.5 and 125 μg/kg， respectively. The total concentrations of seven N-nitrosamines and N-nitrosatable substances in analyzed balloon samples ranged from 0.421 mg/kg to 0.820 mg/kg and from 3.616 mg/kg to 8.437 mg/kg， respectively， which did not comply with the requirement of Directive 93/11/EEC. However， all N-nitrosamines and N-nitrosa-table substances were not detected in analyzed teats and soothers samples.

Keywords Chromatography-positive chemical ionization mass spectrometry; Balloons; N-nitrosamines; N-nitrosatable substances; Solid phase extraction

（Received 17 November 2010; accepted 14 March 2011）