基于金納米粒子/聚阿魏酸/多壁碳納米管修飾電極的DNA計時庫侖法生物傳感器的制備

摘要 構建了基于金納米粒子/聚阿魏酸/多壁碳納米管（AuNPs/PFA/MWCNTs）修飾電極的DNA計時庫侖法生物傳感器。利用循環伏安技術在多壁碳管修飾的玻碳電極表面上聚合一層阿魏酸，在恒電位條件下，在阿魏酸表面沉積金納米粒子， 巰基DNA作為探針通過金硫鍵固定在金納米粒子表面。電化學交流阻抗技術（EIS）與掃描電鏡（SEM）用于表征DNA傳感器的構筑過程。以六氨基合釕（RuHex）作為雜交指示劑，采用計時庫侖法進行檢測。在最佳實驗條件下，檢測信號與待測DNA濃度（1.0×10 ^－14～1.0×10 ^－9 mol/L）的對數呈線性關系；檢出限為 3.5×10 ^－15 mol/L（S/N＝3）。此傳感器具有良好的穩定性和重現性。

關鍵詞 DNA生物傳感器；計時庫侖法；金納米粒子；阿魏酸；碳納米管

2010-09-18收稿；2010-12-13接受本文系國家自然科學基金（No.20675002）資助項目

* E-mail: zhyz65@mail.ahnu.edu.cn

1 引言DNA生物傳感器在癌癥的早期診斷、基因序列分析、環境污染物檢測及生物反恐等方面具有重要的作用?；诓煌瑱z測技術的各種類型的DNA生物傳感器已有報道。電化學生物傳感器因其具有簡單、靈敏、低成本及微型化等優點而備受關注。傳感器的傳感表面的功能化對其分析性能至關重要。近年來，隨著復合材料的發展，聚合物和納米材料越來越多的用于傳感器的制備中。聚合物具有三維空間結構，響應信號大， 其薄膜制備方法簡單，是一種理想的電化學生物傳感器材料。Yang 等^{［1，2］}構建了基于聚2，6-吡啶二甲酸聚合膜的DNA電化學傳感器。納米材料具有高比表面積，可以負載大量探針DNA，對信號呈現明顯放大作用，如碳納米管（Carbon nanotubes， CNTs）和納米金（AuNPs）常用于傳感器中DNA探針的固定及信號放大。利用MWCNTs和AuNPs構建不同類型的DNA傳感器已多有報道^［3～6］。

電化學DNA傳感器的檢測技術一般采用循環伏安（CV）和差示脈沖伏安技術（DPV）^{［7，8］}。近年來，計時庫侖法（CC）因其靈敏度高而備受關注。Zhang等^［9］基于三明治結構構建了計時庫侖DNA傳感器，能檢測fmol/L的靶DNA。文獻［10，11］也報道了幾種類型的DNA計時庫侖傳感器。本課題組報道了基于聚賴氨酸的計時庫侖傳感器，此傳感器能檢測3.5×10^－14 mol/L靶DNA^［12］。

本研究以阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）為聚合物單體，采用循環伏安技術，將其聚合在MWCNTs表面。構建了基于金納米粒子/聚阿魏酸/多壁碳納米管的DNA計時庫侖法傳感器。以RuHex為信號分子，由于RuHex帶正電荷，而DNA 帶負電荷，RuHex通過靜電吸附到DNA鏈上，且它們之間的相互作用符合化學計量關系^［13］， 因此可以通過計時庫侖法定量檢測目標DNA。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑CHI660A電化學工作站（上海辰華儀器公司）；三電極系統：玻碳電極（Φ＝3 mm）或修飾電極為工作電極， 飽和甘汞電極為參比電極， 鉑電極為對電極；pHS-2C精密酸度計（上海偉業儀器廠），JEOLJSM-4800F掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

氯金酸（HAuCl₄·4H₂O）、HCl購自上?；瘜W試劑公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷 （Tris base）、六氨基合釕（［Ru（NH₃）₆］ ^3＋， RuHex）均購自Alfa公司；阿魏酸（FA；Sigma公司）；多壁碳納米管（MWCNTs，直徑為20～30 nm，長度約為30 μm，純度＞95%，中國科學院成都有機化學研究所）；不同序列的DNA均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成：探針DNA: SH-（CH₂）₆-5′-GAG CGG CGC AAC ATT TCA GGT CGA-3′；其互補靶DNA: 5′-TCG ACC TGA AAT GTT GCG CCG CTC-3′；完全不互補靶DNA: 5′-AGC TGG ACT TTA CAA CGC GGC GAG-3′；三堿基錯配的靶DNA: 5′-TCG TCC TGA TAT GTT GGG CCG CTC-3′；單堿基錯配的靶DNA: 5′-TCG ACC TGA AAC GTT GCG CCG CTC-3′，DNA 儲備液由10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）和1 mmol/L EDTA配制，電化學檢測及雜化溶液由10 mmol/L Tris-HCl， 0.25 mol/L NaCl （pH 7.4）配制。其它試劑均為分析純，水為去離子二次石英蒸餾水。

2.2 金納米粒子/聚阿魏酸/多壁碳納米管修飾電極DNA傳感器的制備

（1）將裸玻碳電極按文獻［12］處理并活化，取5 μL MWCNTs懸浮液（1 mg MWCNTs分散于10 mL無水乙醇）滴于活化后的玻碳電極表面，室溫下晾干，用水清洗， 除去未吸附的MWCNTs。將此修飾電極置入1.0×10^－4 mol/L阿魏酸溶液中，在－0.8～0.8 V（vs. SCE）的電位范圍內循環掃描5圈^［14］。聚合后的電極于1 g/L HAuCl₄/0.1 mol/L NaNO₃ 溶液中， －200 mV條件下恒電位沉積20 s，用水沖洗3次， 室溫晾干，得到金納米/聚阿魏酸/多壁碳納米管修飾電極。（2）將6.0 μL探針DNA（10 μmol/L）溶液滴涂到上述修飾電極表面，保持1 h。將DNA探針修飾電極浸泡在0.1% SDS 中5 min， 取出用水清洗電極3次，制備的電極被稱為探針DNA/金納米/聚阿魏酸/多壁碳納米管修飾電極。

2.3 DNA的雜交

將探針DNA修飾電極浸泡到含有不同濃度的靶DNA溶液中雜交30 min（37 ℃），取出電極，分別用0.1% SDS及水清洗3次，除去未雜交的靶DNA。

2.4電化學阻抗譜表征和計時庫侖法檢測

電化學阻抗譜實驗是以5.0 mmol/L K₃［Fe（CN）₆］-K₄［Fe（CN）₆］ （1∶1， V/V）作為氧化還原探針， 實驗參數為電位0.18 V， 頻率范圍為0.1～10⁵ Hz

計時庫侖（CC）的實驗參數: 電位范圍: 0.2～－0.5 V，脈沖持續時間為0.25 s，采樣間隔為0.002 s，RuHex濃度為50 μmol/L。

3 結果與討論

3.1 阿魏酸的電聚合

圖1顯示MWCNTs修飾電極在0.1 mmol/L阿魏酸溶液中的連續循環伏安曲線。第一圈循環掃描，阿魏酸的氧化峰出現在＋0.455 V，還原峰出現在＋0.241 V；掃描第二圈時，其還原峰基本穩定，而氧化峰電位負移到＋0.316 V。隨著掃描圈數的增加，還原峰（P₁）和氧化峰（P₂）的峰電流逐漸增大，說明阿魏酸已聚合在電極表面。根據文獻［14～16］推斷阿魏酸的聚合的機理如下：當進行氧化掃描時，阿魏酸首先失去一個電子成為自由基，然后MWCNTs表面的親核試劑羧基與自由基結合；此外，自由基與丙烯酸基中雙鍵接合形成較大網狀結構（示意圖略）。

3.2 不同修飾電極的電化學阻抗表征

圖2顯示傳感器制備過程中不同階段的電化學阻抗測定的Nyquist曲線（內嵌圖為多壁碳納米管（1），聚阿魏酸/多壁碳納米管（2）以及金納米/聚阿魏酸/多壁碳納米管修飾電極（3）的Nyquist曲線）。在高頻區，曲線包含一個半圓部分，半圓直徑代表電子傳遞電阻（R_ct）的大小，圖中顯示不同制備階段R_ct大小不同，表明氧化還原探針［Fe（CN）₆］^3－/4－在不同修飾電極上的電子傳遞阻力不同。當阿魏酸聚合到碳納米管上后，由于阿魏酸含帶負電的基團（羥基和羧基），與溶液中的［Fe（CN）₆］^3－/4－存在著靜電斥力，因此［Fe（CN）₆］^3－/4－在聚阿魏酸修飾電極上，其R_ct大于碳納米管修飾電極。當金納米粒子沉積到聚合物修飾電極表面上，由于金納米粒子的優異性質加速了探針在電極表面的電子傳遞。當探針DNA固定在修飾電極上，由于ssDNA磷酸骨架所帶負電荷與溶液中的［Fe（CN）₆］^3－/4－存在靜電排斥作用，探針［Fe（CN）₆］^3－/4－在電極表面的R_ct變大（c）。當探針DNA與互補靶DNA雜交后，由于DNA雙鏈形成負電荷量增加， 因此其在電子傳遞能力減弱，即R_ct增大（d）。實驗表明，通過Nyquist曲線半圓直徑，即R_ct的變化可以表征傳感界面的構筑過程。

利用掃描電子顯微鏡（SEM）對不同修飾過程進行表征。圖3為多壁碳管、聚阿魏酸及金納米修飾到電極表面的SEM圖，可見3種分子已分別成功修飾到電極表面。

考察了多壁碳納米管對傳感器信號的影響，分別制備了含及不含碳納米管的兩種傳感器（其它條件相同）。采用同樣濃度的靶DNA（1×10 ^－13 mol/L）進行實驗。結果表明，未修飾多壁碳納米管的傳感器（A）雜交前后的傳感信號分別為4.99和5.45 μC，變化值為0.46 μC；修飾了多壁碳納米管的傳感器（B）雜交前后的傳感信號分別為20.0和25.0 μC。此信號差（5.0 μC）約為前者分析信號差的10倍。說明多壁碳納米管對檢測信號起著明顯的放大作用。

3.3 計時庫侖分析電量分析的原理

采用計時庫侖法進行檢測，其原理用式（1）表示：

其中，Q為總電量；n為電極反應的電子轉移數；F為法拉第常數（C）；A為電極面積（cm²）；D_o為擴散系數（cm²/s）；t為電解時間（s）；C為電活性物的濃度（mol/L）；Q_dl為雙電層的充電電量；nFAΓ₀為吸附的指示劑還原的電量。

當t＝0， 計時庫侖曲線的截距（Q）由雙電層及表面過量吸附的指示劑還原產生的電量構成。表面吸附產生的電量是通過存在及缺少RuHex條件下，通過計時庫侖曲線的斜率的差異判斷（圖4）。通過靜電吸附到DNA磷酸骨架上，因此RuHex分子數與PO^3－₄之間存在化學計量關系，根據電量（Q＝Q_ds－Q_ss）與靶DNA的濃度之間的關系可以定量檢測。

3.4 實驗條件的優化

考察了金納米的沉積時間、探針DNA量以及雜交時間對傳感靈敏度的影響。在5～20 s范圍內，隨著沉積時間的增加，信號逐漸增強；當沉積時間超過20 s后，信號基本保持不變。本實驗中金納米沉積時間選擇為20 s。

考察了DNA探針的量對傳感信號的影響。選用2， 4， 6， 8和10 μL DNA（10 μmol/L）探針，在同樣的實驗條件下測試。結果表明，當探針量達到6 μL時，傳感信號最強，本實驗探針量選擇6 μL。

在0～30 min范圍內，隨著雜交時間的增加，傳感信號逐漸增強，并在30 min時達到最大值。當雜交時間超過30 min，信號幾乎保持不變并略有下降。本實驗的雜交時間選擇為30 min。

3.5 選擇性

選用完全錯配（b）、三堿基錯配（c）、單堿基錯配（d）及完全互補序列（e）的靶DNA分別與探針DNA雜交進行評價， 其結果見圖5。與完全互補靶DNA雜交后信號最強，而與完全錯配的靶DNA雜交時傳感信號最弱，檢測單堿基錯配和三堿基錯配靶DNA時的信號區分明顯。說明生物傳感器能夠明顯區分堿基錯配的靶DNA。

3.6 分析性能

在最佳實驗條件下，采用制備的DNA傳感器對不同濃度的互補DNA進行檢測。結果表明， 傳感信號隨著DNA濃度的增大而增強，且在1.0×10^－14～1.0×10^－9 mol/L 范圍內，檢測信號與濃度的對數呈良好的線性關系（圖6）。其線性回歸方程為：ΔQ（μC）＝41.038＋2.7714logC_DNA（mol/L），相關系數為0.9966，檢出限為3.5×10^－15 mol/L（S/N＝3）。其檢測范圍可達6個數量級，優于先前工作^［12］。

3.7 傳感器的穩定性和重現性

實驗考察了所制備的生物傳感器的穩定性和重現性。重現性的考察是在相同的實驗條件下，用三支不同的玻碳電極構建DNA傳感器，分別檢測 1.0×10 ^－9 mol/L的互補序列DNA，測量的平均值為3.60×10^－5C，相對標準偏差（RSD）達到5.56%。將制備的電極儲存在冰箱中（4 ℃），保存一個星期，然后進行DNA檢測，信號沒有發生明顯變化，證明所制備的這種生物傳感器具有良好的穩定性。

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Fabrication of Dioxyribonucleic Acid Chronocoulometric BiosensorBased on Gold Nanoparticles/Poly （ferulic acid）/MultiwalledCarbon Nanotubes Modified Glassy Carbon Electrode

JIANG Wei， HUANG Lei， ZHANG Yu-Zhong^*

（College of Chemistry and Materials Science， Anhui Key Laboratory of Chem-Biosensing，Anhui Normal University， Wuhu 241000）

Abstract A sensitive chronocoulometric DNA biosensor was fabricated based on gold nanoparticles （AuNPs）/poly （ferulic acid） （PFA）/multiwalled carbon nanotubes （MWCNTs） modified glassy carbon electrode （GCE）. Ferulic acid （FA） was firstly electropolymerizated on the surface of the electrode modified with MWCNTs by cyclic voltammetry （CV）， and AuNPs were subsequently introduced to the surface of the PFA film by electrochemical deposition. Finally， DNA probes （HS-DNA） were immobilized on the surface of the AuNPs/PFA/MWCNTs/GCE via Au-S bond. Electrochemical impedance spectra （EIS） and scan electron microscopy （SEM） were used to investigate the fabrication process of this biosensor. The DNA hybridization events were monitored by chronocoulometry （CC） technique and hexaammineruthenium(Ⅲ) chloride （RuHex） was used as the electrochemical indicator. Under the optimal conditions， the signal of RuHex was linear with the logarithm of the concentration of the target DNA from 1.0×10^－14mol/L to 1.0×10^－9 mol/L with a detection limit of 3.5 × 10^－15 mol/L. Moreover， the DNA biosensor exhibited excellent reprodu-cibility and stability.

Keywords Dioxyribonucleic acid biosensor；Chronocoulometry；Gold nanoparticles；Ferulic acid；Carbon nanotubes

（Received 18 September 2010 accepted 13 December 2011）