電化學和電化學發光核酸適體傳感器

摘要 核酸適體具有親合力強、選擇性高、穩定性好、易于修飾等優點，廣泛用于對目標物如蛋白質、小分子等的靈敏檢測。電化學具有成本低、靈敏度高、儀器小巧等優點。近年來，構建基于核酸適體的電化學傳感器，已經成為一個熱門的研究領域。本文重點評述了2005年以來核酸適體的電化學傳感器的研究進展，并展望其發展前景。

關鍵詞 核酸適體；電化學；傳感器；電化學發光；綜述

2011-01-25收稿；2011-05-11接受

本文系國家自然科學基金 （No.20875086）、科技部項目（No.2006BAE03B08）和吉林省科技廳項目（No. 20082104）資助

* E-mail: guobaoxu@ciac.jl.cn

1 引言

核酸適體是通過指數式富集法配體進化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術從人工合成的DNA 或RNA 隨機庫中篩選出來的，能夠與目標分子進行高親和性和高特異性結合的寡核苷酸序列^［1，2］。與抗體相比，核酸適體具有體外合成、選擇性高、穩定性好、易于修飾等很多優點。構建基于核酸適體的電化學傳感器在藥物篩選、臨床診斷、環境檢測等方面具有廣闊的應用前景。

常見的設計電化學傳感器的方法包括免標記法和標記法，前者的核酸適體不用電化學信號物標記，成本相對低廉，一般多是阻抗型的核酸適體傳感器；后者常用亞甲基藍、二茂鐵等電化學活性物作標記，成本相對較高，一般多用電流型的核酸適體傳感器。依據核酸適體與目標物結合前后的構象變化，可以設計Signal-off和Signal-on兩種傳感模式，前者是基于核酸適體與目標物結合后的信號降低進行檢測，靈敏度一般低于后者。本文對這幾種方法作簡要對比，重點評述了2005年以來核酸適體在電化學傳感器研究領域的進展。

2 核酸適體的電化學生物傳感器的應用

2.1 蛋白質的檢測

蛋白質是一類重要的生物大分子，許多蛋白質在生物體中有著特殊的地位。如凝血酶是一種特殊的絲氨酸內蛋白酶，它的含量與白血病、動脈血栓及肝臟疾病密切相關^［3］。對凝血酶靈敏檢測的電化學傳感器多有報道，如Signal-off型^［4，5］，Signal-on型^［6～10］等。2005年，Xiao等^［11］報道了一個Signal-off型電化學傳感器用于凝血酶的檢測。他們將末端修飾亞甲基藍（MB）的凝血酶核酸適體固定在金電極上。當沒有目標物時，核酸適體以展開的結構存在，電化學信號物MB能夠與電極進行有效電子傳遞，產生較大的電流信號。當目標物存在時，核酸適體與凝血酶結合形成剛性結構，導致MB遠離電極表面，這種構象改變使電流信號明顯下降。該傳感器成功實現了對實際樣品血液中凝血酶的靈敏檢測，檢出限達6.4 nmol/L。該報道提供了一種通用的電化學檢測方法，它實現了快速、靈敏檢測核酸適體結合目標物引起的構象改變。Liu等^［12］設計了測定干擾素IFN-γ的Signal -off型電化學傳感器。他們在干擾素的核酸適體末端修飾MB，將它固定在電極上并形成發夾結構，可以實現MB和電極間的電子傳遞，電流信號較大。當核酸適體與干擾素IFN-γ結合后，發夾結構打開，迫使MB遠離電極表面，阻礙了電子傳遞，電流明顯降低。與傳統的免疫檢測方法相比，該傳感器操作簡便，儀器簡單，并且靈敏度更高，對干擾素IFN-γ的檢出限達到0.06 nmol/L。

然而，Signal-off型電化學傳感器有自身的缺點，例如其原理是根據核酸適體與目標物結合所導致的信號降低而進行檢測，存在背景電流大，檢出限高的缺點，限制了方法的靈敏度。為了解決該問題，Xiao等^［13］設計了一個Signal-on型傳感器。他們先將包含凝血酶核酸適體的寡核苷酸鏈通過金硫鍵固定在金電極的表面，再與末端標記MB的互補鏈雜交形成雙鏈，此時MB遠離電極表面，電流信號很小。當凝血酶與其核酸適體結合后，部分雙鏈解開，拉近了MB與電極表面的距離，電流信號變大，對凝血酶的檢出限達3 nmol/L。該Signal-on型傳感模式為實現快速靈敏地檢測蛋白質及小分子提供了新的思路。Lai等^［14］設計了一個用于直接檢測血液中血小板衍生生長因子（PDGF）的電化學傳感器。他們將末端修飾MB的PDGF核酸適體固定在金電極的表面，此時核酸適體處于半折疊狀態，電流信號較小；當核酸適體與目標物結合后，縮短了MB與電極表面的距離，電流信號變大。該Signal-on傳感器在實際樣品中顯示出優越的穩定性，對血樣和稀釋血樣中PDGF的檢出限分別達到1 nmol/L和50 pmol/L。Wang 等^［15］通過靜電吸附作用將電化學探針［Ru（NH【sub】3【/sub】）【sub】5【/sub】Cl］^2＋固定在電極表面，利用金納米粒子的信號放大效應實現了對PDGF的高靈敏檢測，檢出限達0.01 pmol/L。

石英晶體微天平（QCM）能夠測量微小質量變化引起的共振頻率改變。它利用石英晶體的壓電特性，將電極表面微小的質量變化轉化為石英晶體振蕩的頻率變化，實現對微小質量的測量^［16］。Minunni等^［17］將基于QCM的生物傳感器用于HIV-1激活蛋白的測定。他們利用生物素和親和素之間的特異結合作用，將該蛋白的核酸適體RNA固定在金電極上，實現了對該蛋白的特異性靈敏檢測。與傳統的免疫傳感器相比，該傳感器穩定性更好，靈敏度更高。此外，基于QCM的電化學核酸適體傳感器還被用于對溶液中凝血酶^［18］和IgE^［19］的檢測。

電化學阻抗譜（EIS）是研究生物分子間相互作用的重要技術^［20］。Peng等^［21］構建了基于EIS的電化學傳感器，將溶菌酶的核酸適體及其互補鏈修飾在金盤電極表面，加入溶菌酶后，核酸適體與目標物特異性結合，導致電化學阻抗減小。通過測量加入目標物前后電化學阻抗的變化，實現了對溶液中目標物的靈敏檢測，檢出限達0.07 nmol/L。

電化學發光（ECL）是通過電化學激發反應產生的發光現象^{［22，23］}。它具有靈敏度高、儀器簡單和便于控制等優點，被廣泛用于免疫分析、核酸分析、共反應物分析和生物傳感器的構建^{［24～31］}。Bai等^［32］構建了一個基于核酸適體的ECL生物傳感器，實現了對溶菌酶的高靈敏檢測，檢出限達0.1 pmol/L。納米材料由于具有獨特的電化學性質，在電化學傳感器構建中備受親睞^{［33～38］}。Lin等^［39］設計了一種基于ECL的電化學傳感器，實現了對凝血酶的高靈敏檢測。他們將凝血酶的核酸適體鏈分割成兩段，其中一段的一端固定在金電極表面，另一段的末端修飾上Ru^2＋摻雜的硅納米球（Ru-SNPs）。當凝血酶存在時，它與兩段核酸適體鏈結合形成四極子結構，縮短了Ru-SNPs與電極之間的距離，產生發光信號。這種方法對凝血酶的檢出限達到0.2 pmol/L。

2.2 小分子的檢測

相對于蛋白質等大分子物質，對小分子檢測的電化學傳感器發展相對滯后，進展比較緩慢。這是由于小分子物質與核酸適體的結合常數比較小，因此限制了對小分子目標物的靈敏檢測^{［40，41］}。常見的用于小分子檢測的電化學傳感模式包括免標記型^［42］和標記型^［43］，常用的標記物有MB^［6］、二茂鐵（Fc）^［44］及釕的化合物^{［45，46］}。Zayats等^［47］首次報道了一個免標記的電化學傳感器用于對小分子腺苷的檢測。利用腺苷結合核酸適體前后，電化學阻抗的變化，對腺苷的檢出限達2 SymbolmA@ mol/L。Li等^［48］構建了一個基于EIS的免標記電化學傳感器，將腺苷核酸適體通過其部分互補鏈固定在金電極表面，當溶液中有腺苷目標物時，腺苷與其核酸適體結合，使雙鏈解開，電化學阻抗減小。該免標記傳感器可重復使用性好，實現了對腺苷的高靈敏檢測。Kim等^［49］設計了一個免標記的電化學傳感器用于對腺苷的檢測。當溶液中僅含有Ru（bpy）【sub】3【/sub】^2＋和腺苷的核酸適體時，核酸適體以無規則的卷曲結構存在，Ru（bpy）【sub】3【/sub】^2＋能夠進入該核酸適體中，電流信號較大。當加入腺苷時，它與核酸適體結合導致結構改變，Ru（bpy）【sub】3【/sub】^2＋不易進入該核酸適體，導致電流信號降低。利用這一原理，實現了對溶液中腺苷的檢測。Zhang等^［44］將末端修飾Fc的腺苷核酸適體固定在電極表面。當不加入腺苷時，該核酸適體形成發夾結構，并且末端的部分雙鏈堿基對能夠被核酸內切酶識別并剪切， Fc標記的核酸適體寡核苷酸鏈游離在溶液中，電流信號接近零。當加入腺苷時，核酸適體與腺苷結合，導致核酸適體末端的部分互補堿基對改變，核酸內切酶無法識別，電流信號較大。利用對背景電流的抑制效應，對腺苷的檢出限達到0.1 nmol/L。

構建能夠直接用于對實際樣品的連續、實時檢測的電化學傳感器是一項具有挑戰性的工作。為解決這一難題，Swensen等^［50］設計了一種微流控電化學傳感器芯片，當目標物可卡因與核酸適體進行特異性結合時，核酸適體折疊，產生電化學信號，該信號與體系中目標物的量成正比。該芯片成功地用于對血液中可卡因的定量檢測。值得一提的是，實驗中所用血樣未經過稀釋及其他預處理過程。Du等^［51］利用層層自組裝技術及靜電吸附作用，在銦錫氧化物電極上（ITO）修飾上多層的Fc-聚二甲酰胺膜及金納米粒子，并在金納米粒子上修飾可卡因核酸適體。利用目標物與核酸適體結合前后，DPV信號的變化，實現對可卡因的靈敏檢測。該傳感器在對實際樣品如人體血清及唾液檢測中，顯示出卓越的抗干擾能力。Zuo等^［52］報道了一種夾心法電化學傳感器，他們創新性地將小分子目標物的核酸適體鏈分割成兩段，其中一段通過金硫鍵固定在金電極表面，另一段末端標記上電化學信號物MB。當沒有目標物時，電流信號較小；當目標物存在并與兩段核酸適體結合形成三明治結構時，MB與電極的距離變近，電流信號增強。該方法成功實現了對實際樣品血液中可卡因及ATP小分子的靈敏檢測。與已有的檢測小分子的方法相比，該方法的操作簡便，并且檢測過程中不涉及目標物與核酸適體結合的雙鏈解旋等構象改變過程，因此響應更加快速。

插入法是構建電化學傳感器的常見方法，MB和Ru的化合物常作為插入的電化學信號物^［53］。例如［Ru（bpy）【sub】2【/sub】dppz］^2＋是一個應用廣泛的DNA分子嵌入物，由于其具有伸展的芳香結構，與DNA具有很強的結合力，因此能夠插入DNA分子中。［Ru（bpy）【sub】2【/sub】dppz］^2＋在草酸溶液中的ECL信號可以忽略；而溶液中同時有DNA存在時，［Ru（bpy）【sub】2【/sub】dppz］^2＋插入DNA分子中， ECL信號增強近1000倍。Hu等^［54］利用這一性質，將它用于溶液中ATP的檢測。當ATP存在時，核酸適體與ATP結合，導致［Ru（bpy）【sub】2【/sub】dppz］^2＋的ECL信號下降。這種免標記法實現了對溶液中ATP分子的直接檢測。Dong的小組^［55］設計了一個用于檢測ATP的高靈敏傳感器，利用金納米粒子的信號放大效應及ATP結合核酸適體前后差分脈沖伏安法（DPV）信號的差別，對ATP的檢出限達0.1 nmol/L。Das等^［56］報道了一個基于單壁碳納米管的化學電阻核酸適體傳感器，該傳感器具有很高的靈敏度，對ATP的檢出限達1 pmol/L。

與DNA核酸適體相比，RNA核酸適體的穩定性不高^［57］，很容易被核糖核酸酶降解，因此基于RNA核酸適體的電化學傳感器鮮有報道。Ferapontova等^［58］首次設計了一種基于RNA核酸適體的電化學傳感器。將末端修飾Fc的茶堿RNA核酸適體通過金硫鍵固定在金電極的表面，此時電化學信號物Fc遠離電極表面，電流信號較小。當核酸適體與茶堿結合后，形成發夾結構，這種構象改變拉近了Fc與電極之間的距離，增加了電子傳遞效率，電流信號較大。該傳感器對茶堿的檢出限達0.2 SymbolmA@ mol/L，并可用于對實際樣品血清中茶堿的檢測。

2.3 核酸適體傳感器用于多重檢測分析

構建多功能的電化學傳感器，并且實現對溶液中兩個及兩個以上目標物的靈敏檢測是一個重要挑戰。Du^［59］設計了一個多功能、可重復使用的電化學傳感器。他們將ATP和凝血酶的混合單鏈核酸適體通過其部分互補鏈修飾在金電極的表面。當溶液中的目標物與相應的核酸適體結合時，引起EIS或CV信號的改變，從而實現對ATP和凝血酶的靈敏檢測。檢出限分別達到10 nmol/L和10 pmol/L。這種傳感器利用電化學阻抗圖譜實現了在免標記的前提下，對目標物的高靈敏、可再生及多元分析。此后不久，Du等^［60］在該工作的基礎上構建了一個微流控的電化學核酸適體傳感器，實現了對溶液中小分子物質ATP和可卡因的多元分析。Deng等^［61］將末端互補的腺苷和溶菌酶核酸適體固定在電極表面，然后將電極浸泡在Ru（NH【sub】3【/sub】）^3＋【sub】6【/sub】溶液中，通過靜電吸附作用，Ru（NH【sub】3【/sub】）^3＋【sub】6【/sub】被吸附在核酸適體中。當溶液中含有腺苷或溶菌酶時，由于核酸適體與目標物的結合，導致核酸適體構型發生改變，影響電子傳遞。利用電流信號的變化實現了對腺苷和溶菌酶的同時檢測。此外，實驗還考查了納米粒子對傳感器靈敏度的影響，發現當引入金納米粒子時，對兩個目標物的檢測效果都有明顯提高。Li等^［62］將末端標記CdS及PbS的金納米粒子通過DNA鏈固定在金電極表面。當目標物與對應的核酸適體結合時，金納米球脫落。利用陽極溶出伏安法檢測Cd及Pb的溶出峰，該峰電流與目標物的量成正比，從而實現了對腺苷和凝血酶的靈敏檢測。

3 展 望

2004年，Ikebukuro等首次報道一個基于核酸適體的電化學傳感器^{［63，64］}，實現了對凝血酶的靈敏檢測。隨后，相關的報道不斷涌現^［65］。特別是近5年來，電化學傳感器的發展取得了長足的進步。然而迄今為止，電化學傳感器仍處于發展的早期階段，成功地投入實際應用的仍然很少。未來，構建電化學核酸適體傳感器的工作將可能主要在以下幾個方面展開：（1）發展能夠直接用于復雜生物樣品檢測的電化學傳感器，以實現對癌細胞的早期快速靈敏檢測及對血液等相關疾病的臨床醫學診斷；（2）篩選對小分子具有高親和力的核酸適體^{［66，67］}，并實現對小分子的免標記高靈敏檢測；（3）利用納米材料良好的催化性能及信號放大作用，構建新型納米核酸適體傳感器，以提高傳感器的靈敏度；（4）設計新的傳感模式^［68］，以提高傳感器的可重復實用性及靈敏度；（5）設計小型化、便攜式、價格低廉的電化學傳感器，用于對有毒物質的實時分析。毫無疑問，基于核酸適體的電化學傳感器的研究將仍然是一個活躍的研究領域。

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Electrochemical and Electrochemiluminescent Aptasensors

YUAN Tao^1，2， LIU Zhong-Yuan¹， HU Lian-Zhe^1，2， XU Guo-Bao^*1

¹（State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry， Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022）

²（Graduate University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100039）

Abstract Aptamers have been widely used for the detection of target molecules owing to their chemical stability， easy modification and remarkable specificity and affinity with various target molecules. Electrochemical methods are well known for low cost， high sensitivity and miniature instruments. Recently， the design of electrochemical aptasensors has attracted remarkable attention in the field of biosensors. This paper mainly reviewed the developments of this field since 2005， and the prospects are discussed.

Keywords Aptamer；Electrochemistry；Biosensor；Electrochemiluminescence；Review

（Received 25 January 2011accepted 11 May 2011）