基于碳納米管修飾電極的膽堿電化學(xué)發(fā)光生物傳感器研制

摘要 在碳納米管（CNTs）和K₃Fe（CN）₆修飾的鉑電極上吸附固定膽堿氧化酶，以魯米諾為發(fā)光試劑，研制了膽堿電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器。CNTs可有效提高電極表面的電荷傳輸能力、提高電極表面的生物相容性和對酶分子的固載能力；K₃Fe（CN）₆對酶活性具有激活作用，同時對H₂O₂增敏的魯米諾ECL有增強(qiáng)作用，均有利于提高傳感器的檢測靈敏度。研究表明，將CNTs分散液與K₃Fe（CN）₆混合，滴涂修飾在Pt電極上，吸附固定膽堿氧化酶，制備傳感器。此傳感器在含有8×10^－6mol/L魯米諾的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、30 ℃條件下產(chǎn)生的ECL強(qiáng)度與膽堿濃度在1×10^－7～4×10^－3mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.994，檢出限為1.2SymboltB@ 10^－8 mol/L。此生物傳感器應(yīng)用于鼠血樣中膽堿的測定，測得結(jié)果為2.68 mg/L，平均回收率為101.1%。傳感器具有快速、穩(wěn)定和重現(xiàn)性好等特點，有望應(yīng)用于常規(guī)分析。

關(guān)鍵詞 電化學(xué)發(fā)光；生物傳感器；魯米諾；膽堿；碳納米管

2011-03-08收稿；2011-05-25接受

本文系國家自然科學(xué)基金（Nos. 20275025，20675055）資助

* E-mail：tuyf@suda.edu.cn1 引言

電化學(xué)發(fā)光（ECL）分析法由于其可控性好、靈敏度高、選擇性好、儀器簡單等優(yōu)點已成功應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域。魯米諾是常用的發(fā)光試劑，它具備很好的發(fā)光性能，尤其是對活性氧有良好的響應(yīng)，可作為酶催化反應(yīng)的信號輸出，以研制ECL生物傳感器^［1～3］。諸多酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物為H₂O₂，可以通過H₂O₂對魯米諾ECL的增敏作用實現(xiàn)生物傳感，將ECL的高靈敏度與酶反應(yīng)的高選擇性結(jié)合，具有極好的應(yīng)用前景。

膽堿是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的前體^［4］，在臨床檢驗中，它被用作為如帕金森氏癥和阿爾茨海默氏病腦組織膽堿功能活性的標(biāo)志物^［5～7］。膽堿缺乏被認(rèn)為可能是這些疾病誘因之一，目前膽堿也被列為安全的食品添加劑。測定膽堿常用方法有生物測定方法、氫火焰氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜法等^［8］。近年來開發(fā)了多種分析膽堿的生物傳感器，Hsieh等^［9］利用幾丁質(zhì)，將膽堿氧化酶（ChOx）共價固定于鉑電極表面，用于分析膽堿濃度，檢出限為10.0 SymbolmA@ mol/L， Garguilo等^［10］制備了選擇性監(jiān)測大鼠腦胞外微摩爾濃度膽堿的微型安培傳感器。固定ChOx的方法有多種，是影響其催化活性及穩(wěn)定性和靈敏度的因素^［11］。ChOx可通過聚乙烯醇低溫凝膠膜^［12］、含普魯士藍(lán)的碳糊^［13］及辣根過氧化物酶，共同固定于透析膜支撐的碳糊^［14］等方式固定于電極表面。碳納米管（CNTs） ^［15］由于其高導(dǎo)電性、強(qiáng)吸附性、良好的機(jī)械強(qiáng)度和優(yōu)良的生物相容性，已成功應(yīng)用于生物分子的組裝^［16］。

本研究報道了基于碳納米管修飾電極和魯米諾ECL的膽堿生物傳感器，其酶催化反應(yīng)可描述為^［17］：

Choline＋O₂Betaine aldehyde＋H₂O（1）

作為一種有效的ECL增強(qiáng)劑^［18］，酶催化反應(yīng)所產(chǎn)生的H₂O₂增強(qiáng)了魯米諾的ECL強(qiáng)度。基于此原理，本研究組研制了測定乳酸^［19］、谷丙轉(zhuǎn)氨酶^［20］和尿酸^［21］的ECL生物傳感器。在這些研究中，分別對CNTs和K₃Fe（CN）₆在ECL生物傳感器中的重要作用進(jìn)行了探討，CNTs有效提高了電極表面的生物相容性和電荷傳輸能力，提高了電極表面對酶及其它化學(xué)分子的固載能力；K₃Fe（CN）₆則不僅對酶的活性有很強(qiáng)的激活作用，同時對H₂O₂增敏的魯米諾的ECL具有增強(qiáng)作用^［22］，有利于提高所研制生物傳感器的檢測靈敏度。與文獻(xiàn)［23］報道的膽堿生物傳感器的線性下限5×10^－7mol/L比較，本研究中的膽堿ECL生物傳感器的定量下限和檢出限分別為1×10^－7mol/L 和1.21SymboltB@ 10^－8mol/L，表明本傳感器具有更好的靈敏度。人血清中膽堿的生理濃度約為6～7 SymbolmA@ mol/L（約0.7 mg/L）^［24］，本傳感器可望應(yīng)用于此類樣品的實際檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

由外部脈沖發(fā)生器提供信號的BAS-100A電化學(xué)分析儀（Bioanalytical System Inc.公司）作為電化學(xué)發(fā)光研究的脈沖恒電位源，三電極系統(tǒng)的工作電極和輔助電極均為鉑電極，Ag/AgCl電極為參比電極，所使用的電解脈沖為上限電位0.8 V、下限電位－0.3 V，周期2 s、占空比1∶10。實驗室研制的以光電倍增管為感光元件的PMT-II型微弱光檢測器用作ECL檢測，ECL信號經(jīng)放大后由A/D轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號由電腦記錄。魯米諾和膽堿氧化酶（Sigma-Aldrich公司）。氯化膽堿（上海滬試化工有限公司）。多壁碳納米管（直徑<10 nm，長度0.5～500 SymbolmA@ m，含量＞95%， 深圳納米港有限公司），碳納米管經(jīng)濃HNO₃浸泡10 h、回流5～6 h， 純化、開管并分離干燥后，超聲分散制得固含量為0.33 g/L的二甲基甲酰胺（DMF）分散液。其他試劑均為分析純。大鼠血樣由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供。實驗用水為二次石英亞沸蒸餾水。

2.2 傳感器制備

鉑電極用Al₂O₃打磨拋光，用水沖洗并干燥。滴加4 SymbolmA@ L 0.33 g/L CNTs分散液和2 SymbolmA@ L 0.1 mol/L K₃Fe（CN）₆的混合液，室溫下蒸發(fā)至干，然后滴加含1.5 U的ChOx溶液，并待其蒸發(fā)至干。應(yīng)用此ECL生物傳感器測定膽堿，以含8×10^－6mol/L魯米諾的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）為測試底液，記錄電極上的發(fā)光強(qiáng)度對溶液中膽堿的響應(yīng)。作為對比，制備了未經(jīng)CNTs修飾的傳感電極。該對照電極的制備過程為在預(yù)備好的鉑電極表面經(jīng)浸泡吸附K₃Fe（CN）₆和ChOx。同時，對裸電極上產(chǎn)生的ECL進(jìn)行研究，測定時， K₃Fe（CN）₆和ChOx均溶解于PBS緩沖液中。

2.3 樣品預(yù)處理

將0.1%肝素鈉抗凝的大鼠血液樣本在6000 r/min離心10 min，分離得血清。血清樣品稀釋100倍后分為4份，其中1份用于膽堿的測定

其它3份加入膽堿標(biāo)樣，用于回收率測定。每次測定均取50 SymbolmA@ L樣品注入1 mL PBS后進(jìn)行ECL檢測。

3 結(jié)果和討論

3.1 K₃Fe（CN）₆在傳感器響應(yīng)中的作用利用紫外-可見吸收光譜研究了K₃Fe（CN）₆增敏魯米諾ECL信號的機(jī)理，分別測定了K₃Fe（CN）₆、魯米諾及混合溶液的紫外-可見吸收光譜（見圖1）。K₃Fe（CN）₆與魯米諾溶液混合后，其紫外-可見吸收曲線與混合前溶液吸收曲線的數(shù)學(xué)疊加有顯著差異，位于210 nm左右的K₃Fe（CN）₆的吸收幾乎消失，而魯米諾的吸光度增加。實驗表明，魯米諾和K₃Fe（CN）₆混合時發(fā)生氧化還原反應(yīng)，K₃Fe（CN）₆被還原，但K₃Fe（CN）₆ 的氧化能力不足以將魯米諾化學(xué)氧化至最終產(chǎn)物，只是將魯米諾氧化至高能狀態(tài)，因此魯米諾的吸光性能增強(qiáng)；在施加電解能量時，魯米諾更容易被氧化而產(chǎn)生更強(qiáng)的發(fā)光信號，此推理與K₃Fe（CN）₆增強(qiáng)魯米諾與H₂O₂的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的機(jī)理是一致的。

通常，魯米諾的ECL以在堿性溶液中較強(qiáng)，而在中性及弱堿性條件下極弱，難于測定，這對研發(fā)基于酶催化反應(yīng)的ECL生物傳感器是不利的。研究發(fā)現(xiàn)，K₃Fe（CN）₆對魯米諾ECL的增強(qiáng)作用在中性及弱堿性介質(zhì)中尤為顯著，在pH 6.0～10.0的磷酸鹽緩沖溶液中，ECL光強(qiáng)在pH＝8.0時達(dá)最大，基本滿足ECL生物傳感器的要求。

溫度是影響反應(yīng)速率的重要因素，在0～50℃范圍內(nèi)改變實驗溫度，ECL強(qiáng)度也隨之變化，在30℃時，ECL光強(qiáng)最強(qiáng)。這是由于溫度升高時，魯米諾在電極上氧化生成魯米諾自由基的反應(yīng)速率增加，ECL增強(qiáng)；而溫度更高時，自由基的熱運(yùn)動過于劇烈，導(dǎo)致自由基之間發(fā)生湮滅的機(jī)會增大，使得光強(qiáng)減弱。30 ℃為最佳測定溫度，它同時也能夠滿足酶催化反應(yīng)的要求。

3.2 測定條件優(yōu)化

3.2.1底液pH值的影響 在含3×10^－4 mol/L膽堿的磷酸鹽緩沖液中，考察了溶液的pH值（pH 6.4～9.0）對此ECL生物傳感器發(fā)光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在pH 6.4～7.4之間逐步增加；pH＞7.4后， 發(fā)光強(qiáng)度下降，即pH 7.4為最佳測定酸度，此結(jié)果與文獻(xiàn)［25］一致。對測試底液中魯米諾的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，考慮中等程度的背景和穩(wěn)定的ECL信號，確定魯米諾的最佳濃度為8×10^－6 mol/L。

3.2.2 電極上CNTs/K₃Fe（CN）₆/ChOx修飾量的影響

如圖2所示，修飾電極所用的6 SymbolmA@ L混合液中，0.33 g/L碳納米管分散液和0.1 mol/L K₃Fe（CN）₆溶液的最佳體積比是2∶1，即修飾于電極表面的CNTs和K₃Fe（CN）₆分別為1.32 SymbolmA@ g和0.2 SymbolmA@ mol。

3.2.3 電極表面膽堿氧化酶的固載量的影響 酶的用量決定所研制的生物傳感器的響應(yīng)速率、性能及成本^［26］。本電極表面膽堿氧化酶的固載量對H₂O₂的產(chǎn)生有顯著影響，并影響魯米諾的發(fā)光強(qiáng)度。圖3表明，隨著電極表面ChOx固載量（固定時所用酶量）的增加，發(fā)光強(qiáng)度先增強(qiáng)后降低，最佳固載量為1.5 U。本實驗依靠酶分子和CNTs之間的作用實現(xiàn)酶的固定。當(dāng)酶的固載量較低時，底物（膽堿）過量，酶濃度未達(dá)到飽和，此時酶促反應(yīng)速率與酶濃度呈線性關(guān)系，因而產(chǎn)生的H₂O₂量與酶量成正比，表現(xiàn)為魯米諾的ECL隨酶固載量的增加而增強(qiáng)；當(dāng)較多ChOx固載于修飾電極表面時，將造成酶修飾層的擴(kuò)散阻力增加^［27］，導(dǎo)致魯米諾的ECL隨之降低。

3.3 膽堿ECL生物傳感器的分析性能

在優(yōu)化條件下，本ECL生物傳感器對膽堿的響應(yīng)在1×10^－7 ～4×10^－3 mol/L濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)（I＝0.42＋2.1×10⁷C_Choline），相關(guān)系數(shù)為0.994，圖4b為在10^－7mol/L濃度數(shù)量級范圍內(nèi)的響應(yīng)曲線，按3S計算所得檢出限（LOD）為1.21SymboltB@ 10^－8 mol/L。與之相比，在未采用CNTs修飾制備的膽堿電化學(xué)發(fā)光生物傳感器上，雖也能得到魯米諾的ECL信號，該ECL信號與膽堿濃度之間也有線性關(guān)系，線性響應(yīng)范圍為5×10^－7～2.1×10^－4mol/L （I＝0.29＋2.2×10⁶C_Choline，LOD為1.37×10^－7 mol/L），但由于只是通過吸附實現(xiàn)K₃Fe（CN）₆和ChOx在電極表面的固定，均不是十分穩(wěn)定，故隨著使用時間的延長，其響應(yīng)快速下降，無法得到穩(wěn)定的響應(yīng)值，不能作為傳感器使用。對比研究了裸電極在含K₃Fe（CN）₆、ChOx和魯米諾的PBS緩沖液中的ECL響應(yīng)，雖表現(xiàn)出對膽堿穩(wěn)定的響應(yīng)，但其響應(yīng)極微弱（圖4a）。上述結(jié)果表明，在經(jīng)CNTs/K₃Fe（CN）₆修飾的Pt電極上固定ChOx制作ECL膽堿生物傳感器，所得靈敏度（線性回歸方程斜率）較未經(jīng)CNTs修飾的生物傳感器提高近一個數(shù)量級，檢出限降低一個數(shù)量級，并具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對1×10^－4 mol/L氯化膽堿連續(xù)6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.6%。

3.4 干擾實驗和樣品測定

根據(jù)大鼠血清中可能存在的共存物質(zhì)，通過測定在1×10^－7 mol/L氯化膽堿溶液中加入潛在干擾物質(zhì)所產(chǎn)生的響應(yīng)評估生物傳感器的抗干擾性能，以±10%相對誤差作為外來物種不產(chǎn)生干擾的判據(jù)。結(jié)果表明，20倍抗壞血酸、30倍尿酸、50倍多巴胺、100倍乳酸、50倍Mg^{2＋和Ca2＋}、100倍K^＋和1000倍Na^＋，肝素鈉（抗凝劑），不干擾測定。

應(yīng)用此ECL生物傳感器檢測大鼠血清中膽堿，測定結(jié)果為4.88 mg/L，以血清占全血55%計，可換算得血液中膽堿含量為2.68 mg/L，與大鼠血液中膽堿平均含量范圍相符，測定結(jié)果和回收率見表1，平均回收率為101.1%。人血清中膽堿正常生理含量約0.7 mg／L，現(xiàn)有實驗結(jié)果表明，用此傳感器進(jìn)行測定尚有數(shù)百倍的稀釋容量，因此完全可以用于人血清樣品的測定。

表1 大鼠血清中膽堿濃度的測定和回收率Table 1 Determination of choline in rat serum

4 結(jié) 論

在碳納米管/K₃Fe（CN）₆修飾的鉑電極上吸附ChOx，基于魯米諾的電化學(xué)發(fā)光構(gòu)建一種對膽堿有靈敏和選擇性響應(yīng)的ECL生物傳感器，優(yōu)化了傳感器研制和檢測的最佳條件。酶反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，可得到發(fā)光強(qiáng)度與溶液中底物膽堿濃度的線性關(guān)系。對所制備傳感器分析性能進(jìn)行了表征，并應(yīng)用于大鼠血清中膽堿的檢測。該傳感器顯示了對膽堿的快速響應(yīng)并具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，較寬的線性范圍和低的檢出限，為膽堿檢測在醫(yī)療應(yīng)用領(lǐng)域的潛在應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

References

1 Hu L Z， Xu G B. Chem. Soc. Rev.， 2010， 39: 3275～3304

2 Wei H， Wang E K. Trends in Analytical Chemistry， 2008， 27： 447～459

3 LI Hai-Juan， HAN Shuang， HU Lian-Zhe， XU Guo-Bao （李海娟， 韓雙， 胡連哲， 徐國寶）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2009， 37（11）: 1557～1565

4 Tsafack V C， Marquette C A， Pizzolato F， Blum L J. Biosensors and Bioelectronics， 2000， 15: 125～133

5 Rinne J O， Myllykyla T， Lonnberg P， Marjamaki P. Brain Res.， 1991， 547: 167～170

6 Jenny A， Ashok K， Reinhard S. Brain Res.， 2002， 953: 17～30

7 Margrit K， Jenny A， Ashok K， Dietlind S， Osama S， Jrg S， Matthias S， Reinhard S. Int. J. Dev. Neurosci.， 2003， 21: 357～369

8 Yao D C， Vlessidis A G， Evmiridis N P. Anal. Chim. Acta， 2002， 462： 199～208

9 Hsieh B C， Matsumoto K， Cheng T J， Yuu G， Chen R L C. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2007， 45： 673～678

10 Garguilo M G， Michael A C. J. Neurosci. Methods， 1996， 70： 73～82

11 Qin X， Wang H C， Wang X S， Li S， Miao Z Y， Huang N， Chen Q. Mater. Sci. Eng. C， 2009， 29： 1453～1457

12 Doretto L， Ferrara D， Lora S， Schiavon F， Veronese F M. Enzyme Bicrob. Technol.， 2000， 27： 279～285

13 Moscone D， Ottavi D D， Compagnone D， Palleschi G. Anal. Chem.， 2001， 73: 2529～2535

14 Razola S S， Pochet S， Grosfils K， Kauffmann J M. Biosens. Bioelectron.， 2003， 18： 185～191

15 Iijima S. Nature， 1991， 354: 56～58

16 Upadhyay A K， Ting T W， Chen S M. Talanta， 2009， 79： 38～45

17 Bai Y H， Du Y， Xu J J， Chen H Y. Electrochem. Commun. 2007， 9： 2611～2616

18 Chu H H， Guo W Y， Di J W， Wu Y， Tu Y F. Electroanal. 2009， 21： 1630～1635

19 Cai X， Yan J L，Chu H H， Wu M S， Tu Y F. Sensors and Actuators B， 2010， 143： 655～659

20 Chu H H， Wu M S， Cai X， Tu Y F. Biosensor， 2010， Glasgow， UK2010： 5

21 Wu M S， Chu H H， Cai X， Tu Y F. First Bio-Sensing Technology Conference， Bristol， UK 2009：11

22 WU Mei-Sheng， CHU Hai-Hong， TU Yi-Feng（吳梅笙，儲海虹，屠一鋒）. Journal of Suzhou University of Science and Technology: Science Edition （蘇州科技學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版）， 2009， 26（4）： 35～38

23 SONG Zhao， HUANG Jia-Dong， SHI Hai-Bin， WU Bao-Yan， ZHAO Zi-Xia， CHEN Qiang（宋 昭，黃加棟，史海濱，吳寶艷，趙紫霞，陳強(qiáng)）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學(xué)）， 2006， 34： 910～914

24 Jacob R A， Jenden D J， Allman-Farinelli M A，Swendseid M E. J. Nutr.， 1999， 129（3）： 712～717

25 Curulli A， Valentini F， Orlanduci S， Terranova M L， Palleschi G. Biosensors and Bioelectronics. 2004， 20： 1223～1232

26 Ong A L， Kamaruddin A H， Bhatia S， Long W S， Lim S T， Kumari R. Enzyme Microb. Technol.， 2006， 39： 924～929

27 KANG Tian-Fang， LIU Run， LU Li-Ping， CHENG Shui-Yuan（康天放，劉潤，魯理平，程水源）. Chinese J. Appl. Chem. （應(yīng)用化學(xué)）， 2006， 23： 1099～1103

Development of Electrochemiluminescent Biosensor for Choline Based onCarbon Nanotubes Modified Electrode

ZHAO Jin-Jin， WU Mei-Sheng， TU Yi-Feng^*

（Department of Chemistry， Soochow University， Dushu Lake Higher Education Town， Industrial Park， Suzhou 215123）Abstract An electrochemiluminescent （ECL） choline biosensor was developed by drop- coating of choline oxidase （ChOx） onto a carbon nanotubes （CNTs）/potassium ferricyanide modified platinum electrode with ECL of luminol as readout signal. Due to the improvement of biocompatibility and electron transfer of electrode surface from CNTs， meanwhile the activation for enzyme and the ECL emission from K₃Fe（CN）₆， the developed biosensor possesses excellent analytical properties. The biosensor gives optimal results while the Pt electrode was modified with 4 SymbolmA L of 0.33 g/L CNTs dispersoid， 2 SymbolmA L of 0.1 mol/L K₃Fe（CN）₆ and 1.5 U of ChOx. In the PBS buffer （pH 7.4） containing 8×10^－6mol/L luminol， the ECL signal linearly responded the concentration of choline from 1×10^－7mol/L to 4×10^－3mol/L （r＝0.994） with detection limit of 1.21×10^－8mol/L under 30 ℃ of detection temperature. The developed biosensor was applied to assay the concentration of choline in rat blood sample. The result of 0.268 mg/100 mL was obtained with average recovery of 101.1%. It shows a fast response to choline with good reproducibility.

Keywords Electrochemiluminescence；Biosensor；Luminol；Choline；Carbon nanotubes

（Received 8 March 2011accepted 25 May 2011）