高效液相色譜法紫外與激光誘導熒光檢測蛋白質的分析對比

摘要 將鼠肝腫瘤組織蛋白及其酶解產物經4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜惡二唑（NBD-F）在50 mmol/L硼砂緩沖溶液（pH8.5）中室溫避光衍生1 h后，采用高效液相色譜-激光誘導熒光檢測法（HPLC-LIF）分析（λ_ex＝473 nm， λ_em＝525 nm），并與高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）在檢測波長214 nm所得結果進行對比。對蛋白質酶解產物的分析結果表明，LIF檢測器因其更高的檢測靈敏度，可顯著提高檢測能力，多數色譜峰較紫外信號高10倍以上，最終多檢測到42個峰。進一步對鼠肝腫瘤組織蛋白提取液的檢測結果進行對比，HPLC-UV法檢測到的組分集中在強極性區域，說明樣品中極性組分的紫外吸收較強；HPLC-LIF法檢測到的組分更多集中在弱極性和非極性區域，一方面因為衍生化能夠改變組分的極性，另一方面因為弱極性和非極性組分更容易被衍生化，此結果也說明兩種方法對樣品的檢測選擇性存在明顯差異。通過改變熒光衍生化反應條件（溶液pH值、緩沖液介質）對復雜樣品進行選擇性標記，有利于實現對低豐度蛋白和多肽的選擇性檢測。

關鍵詞 蛋白；多肽；激光誘導熒光；高效液相色譜

2010-11-10收稿；2010-12-29接受

本文系國家重點基礎研究發展規劃（973）項目（No.2011CB910400）、上海市科委專項基金（No.10dz2220500）和華東理工大學優秀青年教師基金（No.YJ0157/45）資助項目

E-mail: minbolan@ecust.edu.cn

weibingzhang@dicp.ac.cn

1 引言

對具有重要生理或病理功能的低豐度蛋白進行定性與定量分析是蛋白質組學研究的重要內容。目前，能夠與高效液相色譜串聯用于復雜生物樣品分析的檢測方法，包括質譜法^{［1，2］}、紫外法^［3，4］和熒光法^［5，6］等。質譜法能夠提供豐富的分子片段信息，是蛋白質定性的首選方法；但質譜定量過程復雜。與之相比，光譜法檢測不僅操作簡便，而且可以與色譜無損聯接，是快速定量分析的理想選擇。最常用的紫外檢測器及普通熒光檢測器靈敏度相對較低，限制了其在低豐度蛋白檢測中的應用。

激光誘導熒光檢測器采用激光作為激發光源，具有極高的檢測靈敏度（比紫外法高3～4個數量級^［7～9］），甚至可實現單分子檢測^［10］。Katzenmeyer等^［11］構建了高效液相色譜-激光誘導熒光-質譜（HPLC-LIF-MS）聯用系統，對抗腫瘤藥阿霉素（Doxorubicin）及兩種代謝產物進行了定性與定量分析，LIF檢測器的引入使得藥物代謝過程中的實時濃度監測成為可能。Kumar等^［12］采用HPLC-LIF法對蛋白含量低至10^－15～10^－16 mol級的乳房組織提取液進行分離檢測，并結合主成分分析（PCA）對不同試樣（正常、惡性、良性及經過處理的樣品）進行分類研究；Bhat等^［13］采用類似方法對子宮頸細胞試樣開展研究，證實HPLC-LIF方法靈敏度高、特異性好，將其與PCA等數據處理方法結合有望用于對腫瘤組織的診斷。

本研究以鼠肝腫瘤組織蛋白為研究對象，比較了高效液相色譜-激光誘導熒光檢測法（HPLC-LIF）及高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）的檢測靈敏度和選擇性，說明其在復雜生物樣品中低豐度蛋白定量分析方面的特征。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

高效液相色譜系統：P230II高壓恒流泵，UV230II紫外-可見檢測器，LIFD230激光誘導熒光檢測器（大連依利特分析儀器有限公司）；Arium611超純水儀（德國Sartorious公司）。

鼠肝腫瘤組織蛋白提取液（復旦大學提供）；牛血清白蛋白和胰蛋白酶（Sigma公司）；4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜惡二唑（日本TCI公司）；Na₂B₄O₇·10H₂O和NH₄HCO₃（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇（色譜純，上海星可化學試劑有限公司）；實驗用水均為Milli-Q超純水。

2.2 實驗方法

2.2.1 鼠肝腫瘤組織蛋白的酶解 移取200 μL鼠肝腫瘤組織蛋白提取液至1.5 mL離心管中，將離心管放在

75 ℃水浴中加熱10 min使蛋白失活。待溶液冷卻至室溫后，向離心管中加入50 μL胰蛋白酶水溶液（1 g/L）和750 μL 50 mmol/L NH₄HCO₃溶液（pH 8.0），混勻，將裝有上述溶液的離心管置于37 ℃搖床振蕩反應12 h，放入－20 ℃冰箱終止酶解并冷凍保存。

2.2.2 蛋白及其酶解產物的衍生 選用衍生條件溫和，反應速率快，熒光量子產率較高的衍生化試劑4-氟-7-硝基-2，1，3-苯并氧雜惡二唑（NBD-F）^{［14～18］}對蛋白質及其酶解產物進行衍生。反應條件：向500 μL離心管中依次加入10 μL 鼠肝腫瘤組織蛋白提取液、10 μL 10 mmol/L NBD-F（溶于色譜純乙腈）及80 μL硼砂緩沖溶液（50 mmol/L， pH 8.5），混勻后于室溫避光反應1 h。采用相同方法對牛血清白蛋白和鼠肝腫瘤組織蛋白酶解產物進行衍生化反應。

2.2.3 HPLC-UV及HPLC-LIF分離-檢測條件 紫外檢測波長為214 nm；激光誘導熒光檢測的激發波長和發射波長分別為473和525 nm。SinoChrom ODS-BP色譜柱（250 mm×4.6 mm i.d.）對各種試樣進行分離，根據被分析物性質的不同，流動相（流速為1.0 mL/min）采用不同的洗脫梯度，具體見表1。

3 結果與討論

3.1 衍生化反應溫度和時間的確定

考慮到實際試樣成分復雜且未知，首先用NBD-F對牛血清白蛋白（BSA）標準品進行衍生，并考察了反應溫度、反應時間等因素對反應結果的影響。結果表明，提高反應溫度能加快衍生化反應速率，但副產物含量同時增大；采用室溫避光反應不僅可以有效減少副產物的生成，同時也避免了高溫對生物試樣的破壞。衍生化反應轉化率在1 h后達到最大，產物在4 h內基本保持穩定。

3.2 牛血清白蛋白的檢測

3.2.1 HPLC-UV法 由BSA的HPLC-UV色譜圖（圖1）可見，BSA的檢測信號在5 min左右。檢測不同濃度BSA的HPLC-UV色譜圖。當BSA濃度在0.035～0.1 μmol/L范圍內，兩者呈線性關系：Y＝16.43X＋0.51（Y為峰高，mV；X為BSA濃度，μmol/L；相關系數r＝0.9979），由S/N＝3可求得本方法對BSA的檢出限為1.1×10^－8 mol/L。

3.2.2 HPLC-LIF法 在實驗條件下，NBD-F與BSA衍生化產物在27.5 min左右出峰（圖2中峰2），盡管NBD-F在堿性條件下會水解生成副產物NBD-OH（峰1），但該峰的存在對BSA的檢測無明顯影響。根據BSA衍生化產物峰強度與BSA濃度呈線性關系： Y＝230.00X＋44.7（Y為峰高，mV；X為BSA濃度，g/L；相關系數r＝0.9972）， 線性范圍0.035～1.5 μmol/L。由S/N＝3求得該法對BSA的檢出限可達1.2×10^－9 mol/L，其檢測靈敏度比紫外法提高了10倍。

3.3 鼠肝腫瘤組織蛋白的檢測

為了便于比較兩種方法所得結果，根據流動相極性（即流動相中甲醇的含量）將鼠肝腫瘤組織蛋白及其衍生化反應產物大致分為強極性組分、弱極性組分以及非極性組分。表2列出了3類組分所對應的流動相中甲醇含量及其在HPLC-UV法和HPLC-LIF法中相應的保留時間。

3.3.1 HPLC-UV法 鼠肝腫瘤組織蛋白提取液中含有大量的蛋白保護劑（如苯甲基磺酰氯、硫脲、尿素等），這些物質在214 nm檢測波長下具有較強的紫外吸收（如圖3a中3～5 min處的強峰），對極性蛋白質的檢測存在一定干擾。樣品在各區域的色譜峰數目為：強極性區域27個（扣除蛋白保護劑），弱極性區域1個，非極性區域4個（圖3），表明蛋白提取液中強極性組分的紫外吸收較強，而弱極性組分和非極性組分的紫外吸收較弱。HPLC-UV法比較適用于該樣品中強極性組分的分離檢測。

3.3.2 HPLC-LIF法 圖4是鼠肝腫瘤組織蛋白熒光衍生化產物的HPLC-LIF色譜圖（50 mmol/L， pH 8.5硼砂緩沖溶液）。與圖3相比，鼠肝腫瘤組織蛋白提取液在強極性區域檢測到的色譜峰的數目有所減少，但峰的強度明顯增強，最大增強倍數超過100倍（如峰A～E）；在弱極性區域檢測到的色譜峰的數目明顯增多；在非極性區域，不僅峰的數目增多，而且檢測靈敏度也有較大的提高（如峰F～I的信號增強倍數均大于100倍）。HPLC-LIF法在強極性區域檢測到的峰數目減少，而在弱極性和非極性區域檢測到的峰數目增多可能因為：弱極性和非極性組分比強極性組分更易于與熒光衍生化試劑反應；部分強極性組分在被衍生化后極性降低，產物峰的位置出現在弱極性區域。此外，HPLC-LIF法有效避免了因溶劑吸收而導致的基線漂移現象，在一定程度上也提高了對弱極性和非極性組分的檢測靈敏度。

3.4 鼠肝腫瘤組織蛋白酶解產物的檢測

將蛋白質大分子酶解成小分子肽段是研究蛋白質結構及生理功能的常用方法，本研究對鼠肝腫瘤組織蛋白酶解產物進行了HPLC-UV法和HPLC-LIF法分析。以峰高0.6 mV為積分閾值時，鼠肝腫瘤組織蛋白酶解產物在HPLC-UV圖譜上共檢測到63個峰（圖5）；而在HPLC-LIF圖譜上檢測出105個峰（圖6），比前者多42個峰，提升近60%。

3.5 衍生條件對選擇性的影響

在控制其它衍生化反應條件不變的情況下，考察了緩沖溶液的pH值和無機鹽介質對鼠肝腫瘤組織蛋白衍生化產物的影響，結果見圖7。隨著溶液pH值的降低，鼠肝腫瘤組織蛋白在弱極性和非極性區域檢測到的色譜峰數目減少、強度降低，表明溶液堿性的降低不利于弱極性和非極性組分與NBD-F反應。在pH 8.5時，強極性區域檢測到的色譜峰數目和強度達最大值，說明弱堿性條件有利于強極性組分的衍生化反應。由圖7可知，在NH₄HCO₃緩沖溶液中，大多數組分的信號強度明顯降低。 但在110 min處出現一新峰（J），說明改變反應介質能調節衍生化反應的選擇性。

上述結果表明：復雜試樣的衍生化程度和產物種類隨著衍生化反應條件的不同而改變。通過改變反應條件可以提高對某些組分的選擇性（包括選用不同的熒光衍生化試劑、改變反應溫度、調節溶液pH值、延長或縮短反應時間等），從而達到對這些組分選擇性分析的目的。HPLC-LIF檢測法對3種試樣都顯示出比HPLC-UV法更高的靈敏度，除了因檢測原理不同而顯示出的技術優越性外，選用反應活性好、熒光量子產率高、激發和發射波長與儀器匹配的熒光試劑對目標分析物進行衍生化是提高檢測靈敏度的重要因素。此外，熒光檢測可以有效降低復雜試樣的背景干擾，在一定程度上也提高了對低豐度組分的檢測能力。

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Comparative Study on Determination of Proteins by High PerformanceLiquid Chromatography with Ultraviolet or Laser-InducedFluorescence as Detector

MA Li-Min¹， SONG Lun¹， QIAN Jun-Hong¹， ZHANG Ling-Yi¹， LAN Min-Bo^1，2， ZHANG Wei-Bing¹

¹（Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry， and Research Centre of Analysis and Test，East China University of Science and Technology， Shanghai 200237）

²（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology， Shanghai 200237）Abstract The protein sample extracted from rat liver tumor tissues and its enzymic hydrolysates were detected by high performance liquid chromatography-laser induced fluorescence detector（HPLC-LIF） （λ_ex＝473nm， λ_em ＝ 525 nm） after labeled with 4-fluoro-7-nitro-2，1，3-benzoxadiazole （NBD-F） in dark at room temperature for 1 h with borate buffer （50 mmol/L， pH＝8.5） as reaction medium， and the results were compared with those obtained from HPLC-UV （at 214nm） without derivatization. The analysis of enzymic hydrolysates shows that LIF detector can greatly improve the detection by its high sensitivity: the peak intensities of most components are 10 times higher than UV detection and 42 peaks more were observed. For the analysis of protein sample， most of the peaks detected by UV are located in strong polarity area， which indicates that these components with strong polarity have high UV absorption. The signals obtained from LIF are located in weak polarity or non-polarity area. One reason is that derivatization can change the polarity of the components， and the other is that components with weak or non-polarity might be labeled more easily. This result also suggests selectivity difference between these two methods over the real protein sample. In addition， selective label of complex sample by changing reaction conditions （such as pH and reaction media） enables to achieve high sensitive detection of low abundance proteins and peptides with better selectivity.

Keywords Proteins；Peptides；Laser-induced fluorescence；High performance liquid chroma-tography

（Received 10 November 2010 accepted 29 December 2010）