非標記液相色譜-質譜聯用蛋白組學并行分析策略研究

摘要 在雙酶雙碎裂條件下，建立了針對非標記液相色譜-質譜聯用蛋白質組學的并行分析策略。應用擁有碰撞誘導解離（CID）和電子轉移解離（ETD）兩種碎裂方式的液相色譜-質譜聯用對經胰蛋白酶和V8酶分別酶解的牛血清白蛋白（BSA）、大腸桿菌及復雜血清樣品進行檢測。與單酶酶解比較，雙酶酶解的蛋白總發現率增加了11%，蛋白總覆蓋率可增加10%以上；CID/ETD結合模式分別比CID、ETD模式多鑒定出87和263個大腸桿菌蛋白；對于復雜樣品的分析，采用雙酶雙碎裂并行方式，可使人、豬和兔的血清蛋白檢出率分別提高21%、20%和10%。采用并行策略提高了非標記蛋白組分析的效率，并且由于并行方式的互補性，為數據提供了交叉驗證，使結果更為可靠。

關鍵詞 液相色譜-質譜聯用；蛋白組；并行分析

2010-09-28收稿；2011-01-10接受

本文系國家十一五重大新藥創制-基于腦病治療的中藥復方藥理學及藥效學評價關鍵技術研究（No.2009ZX09502-014）資助項目

E-mail:caojin@tsinghua.org.cn

1 引言

長期以來，尋找蛋白標記物、了解蛋白組輪廓等蛋白組相關分析多應用二維凝膠技術（2D Gel electrophoresis）^［1，2］，及隨后發展的二維熒光差異凝膠電泳（2D Fluorescence difference gel electrophoresis）技術^［3］，結合質譜鑒定對復雜蛋白混合物進行定性與定量分析。然而，由于所獲取結果的不確定性及所有2D膠的方法都具有的共同缺陷，如動態范圍偏窄、對疏水蛋白的檢測及具有極端分子量和等電點的蛋白檢測較困難等，使此類方法的應用和發展受到局限。

近幾年，鳥槍式（Shotgun）的蛋白組分析技術，如多維蛋白鑒定技術（Multidimensional protein identification，MudPIT），由于能夠為復雜生物體系中大規模的蛋白表達及其特征研究提供強大的分析能力^［4～6］，使得基于非凝膠蛋白組分析技術獲得了很大地發展。其中，同位素標記的方法，如在蛋白水平標記的細胞培養液穩定同位素標記技術（Stable isotope labeling of amino acids in cell culture， SILAC）^［7］、同位素親和標簽技術 （Isotope-coded affinity tags， ICAT）^［8］，肽段水平標記的同位素標記相對和絕對定量技術（Multiplexed isobaric tags for relative and absolute quantification， iTRAQ）^［9］等方法，為復雜樣品的定量蛋白組研究中提供了許多有價值的信息，不過這些方法由于樣品制備的時間長、操作復雜、標記的專屬性不佳、檢測的動態范圍有限等缺點，限制了方法的適用范圍和發展。鑒于此，非標記的蛋白組學方法備受關注，雖然理論上不如同位素標記準確，但是在技術上避開了同位素標簽技術的上述缺點，通過大量譜圖記錄和比較，提供了大量相對蛋白豐度的差別信息，因此蛋白質組的非標記技術逐漸成為研究的主要方向。其中，對于非標記方法如何提高蛋白發現率、覆蓋率，使假陽性率降低，分析結果更加準確可靠成為研究者關注的一個熱點^［5］。

目前，不同分析方式方法結合的并行質譜分析策略由于檢測的蛋白質量范圍更廣，結果準確性更高，因此越來越受到研究者關注。Chen等^［10］應用3種酶對人肝臟組織分別進行酶解，通過糖蛋白質組學的分析發現，應用多種酶進行酶解能夠發現用單酶酶解所未發現的位點，能夠獲得更多肽段信息，還可提高蛋白鑒定時氨基酸序列的覆蓋率。在質譜碎裂模式上，除原有碰撞誘導解離（CID）外，近年來發展的電子轉移解離（ETD） 是一種新型肽段序列測定技術。與CID 不同，ETD 并不斷裂肽段上微弱的翻譯后修飾化學鍵，而是斷裂肽段主鏈本身，產生互補性的c 和z 離子。Molina等^［11］對CID和ETD兩種碎裂方式進行了系統的比較，發現應用CID比用ETD鑒定出的蛋白多50%，而ETD比CID的氨基酸序列覆蓋率增加了20%，而兩種碎裂方式結合使胰蛋白酶的肽平均序列覆蓋率增加至92%。這兩種碎裂技術交替應用能夠增加離子碎片的信息量，因而提高了肽段序列覆蓋率和肽段、蛋白鑒定結果的可靠性^［12］。Altelaar等^［13］應用兩種肽段提取方法結合兩種質量精確性高的質譜以及不同的碎片裂解方式對內源性神經肽進行鑒定，發現這種結合方式能夠提高內源性神經肽的鑒定效率，提高了鑒定結果的可靠性。

本研究通過酶解方法和離子碎裂方式的比較優化，以期提高蛋白發現率、個別蛋白總的覆蓋率，建立兩種互補酶解方式及互補碎裂方式等結合的非標記蛋白組分析方法，并應用于多種動物種屬的復雜生物樣品體系中。對本方法的實用性及適用性進行驗證。本方法建立的并行分析策略參見圖解1。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑Agilent 6340 Ion Trap液相色譜-質譜聯用儀（Chip-ESI源），Agilent 1200 納升液相色譜，Agilent Chemstaion色譜工作站（美國Agilent公司）；AE240電子分析天平（德國Mettler Toledo公司）；KDS100CE注射泵 （美國KD Scientific公司）；蛋白分析用Chip C₁₈柱 （15 cm× 75 μm，美國Agilent公司）；離心機（美國Thermo公司）。

三羥甲基氨基甲烷（Tris，美國Amresco公司）

三羧乙基膦（TCEP）、胰蛋白酶（Trypsin）、V8（美國Thermo公司）

牛血清白蛋白（BSA）、碘代乙酰胺IAA（美國Sigma公司）

乙腈、丙酮（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸（分析純，美國J.T.Braker公司），實驗用水為飲用純凈水。

2.2 蛋白樣品制備

2.2.1 BSA溶液 稱取0.003 g BSA，用50 mmol/L Tris緩沖液（以甲酸調至pH 8.5）溶解至終濃度為6 g/L，吸取20 μL BSA溶液進行酶解。

2.2.2 大腸桿菌 吸取適量大腸桿菌于培養瓶的牛肉湯中，放置37 ℃的培養箱中24 h，離心，取沉淀。用鹽水反復清洗3遍再離心，去除牛肉湯，取沉淀。加入蛋白裂解液溶解，間歇超聲，4 ℃放置過夜。在4 ℃，以12000 r/min離心15 min，取上清液，加入3倍體積－20 ℃預冷的丙酮，渦旋振蕩1 min，4 ℃沉淀過夜，以8000 r/min離心15 min， 取沉淀，使丙酮揮發完全，－70 ℃保存。

2.2.3 血清 取50 μL血清與等體積50 mmol/L Tris緩沖液混合，渦旋1 min，加入3倍體積－20 ℃預冷的丙酮，渦旋振蕩1 min，4 ℃沉淀過夜，以8000 r/min離心15 min，取沉淀，使丙酮揮發完全，－70 ℃保存。

采用用BCA法測定蛋白濃度。

2.3 蛋白質酶解

將蛋白溶解于50 mmol/L Tris 緩沖液（pH 8.5）中，濃度1～3 g/L；活化Trypsin后，以蛋白含量與酶液比例為20∶1加入酶液，37 ℃水浴6 h，每小時渦旋振蕩1次，此為第一次消解；加入1 mmol/L TCEP，37 ℃水浴30 min，放冷至室溫；進行烷基化，3 μL IAA溶液對應10 μg蛋白，37 ℃水浴20 min（避光）；第二次消解，以蛋白含量與酶液比例為30∶1加入酶液，37 ℃水浴過夜；終止反應，每50 μL溶液加入2 μL甲酸；在4 ℃，以12000 r/min離心15 min，取上清液分析。V8酶解方法同上。

2.4 質譜及色譜條件

質譜條件：掃描模式（Scan mode）：Ultra Scan；離子源（Source）：ESIChip；陽離子模式（Positive）；毛細管電壓（Capillary）：-1900 V；干燥氣溫度（Dry temp.）：300 ℃；干燥氣（Dry gas）流速：3.0 L/min；透鏡（Skimmer）：30 V；毛細出口電壓（Cap Exit）：100 V；阱驅動參數（Trap drive）：80.0；離子累積數（Smart target）：500000；采集時間（Accu time）：200 ms；MS/MS 碎裂電壓（Frag amp）：l.0 V；質量范圍：m/z 300～2000。ETD：反應采集時間（Reactant accu time）：10 ms；截止值（Cut off）：200；反應時間（Reaction time）：100；前體離子個數（No. of precursor ion）：7；釋放時間（Release time）： 0.8 min。

色譜條件：Chip：150 mm 300A C₁₈ chip w/40 nL 富集柱；進樣量：0.15 μL；泵1（納升泵，Nano pump）流動相：A為97%水-3%乙腈-0.1%甲酸，B為90%乙腈-0.1%甲酸；流速：0.3 μL/min；梯度洗脫：0～70 min， 3%～45% B；70～85 min， 45%～90% B

85～95 min，90%～100% B；95～110 min， 100%B；110～115 min， 100%～3% B；115～125min，3% B。運行時間：125 min。泵2（毛細泵，Capillary pump）流動相：A為水－0.1%甲酸，B 為90%乙腈-10%水-0.1%甲酸；流速：3 μL/min；梯度洗脫：0～4 min， 0% B；4～5 min， 0～80% B

5～85 min，80% B，流速為0 μL/min；85～95 min，80%～100% B，流速恢復至3 μL/min；95～96 min，100%～0% B；運行時間： 125 min。

2.5 MS/MS數據搜索和處理

應用Agilent Spectrum Mill軟件（A.03.03.080）進行MS/MS數據分析。通過搜索參數和驗證參數嚴格的設置，得到準確性高的搜索結果。參數設置：數據庫（Database）: Swissprot消化酶（Digest）: Trypsin 或 V8允許最大酶切位點（Maximum issed cleavages）: 2固定修飾（Fixed modification）: Carbamidomethylation（C）

母離子質量允差（Precursor mass tolerance）: ±2.5Da

子離子質量允差（Product mass tolerance）: ±0.7

過濾肽段分值（Filter peptides by score）＞6， 峰強度百分比值（Scored peak intensity， SPI） ＞60%

過濾蛋白分值（Filter by protein score） ＞11。Mascot搜索參數類似。

應用Agilent chemstaion色譜工作站中DataAnalysis軟件進行圖譜分析；Agilent Spectrum Mill軟件（A.03.03.080）進行蛋白搜索；Minitab14軟件進行5因素4水平（L16 （4X5））正交實驗數據的分析；Excel 2007進行數據的統計學分析。

3 結果與討論

3.1 非標記液質蛋白組學研究過程及條件優化

3.1.1 兩種酶解方式過程優化 為了提高酶解效率，本實驗進行了兩步酶解。當蛋白經預冷丙酮沉淀后，蛋白質復溶是實驗的關鍵。為了使沉淀蛋白復溶得更好，盡量減少蛋白丟失，在蛋白沉淀后，需8000～9000 r/min離心，才能做到蛋白沉淀松緊適度，復溶效果好，而且丙酮去除較完全。另外，在揮干丙酮時，時間不宜太長，樣品不能過于干燥，否則也不利于蛋白復溶。在完全去除丙酮后，于室溫放置10 min即可。揮干丙酮后，第一次加入酶液進行渦旋振蕩混和，可看到大部分蛋白可形成密度合適的混懸液；第二次加入酶液時，蛋白可完全溶解，預實驗中經溶液內加入較多量有機溶劑進行測試，未出現明顯的渾濁或者沉淀。說明進行兩步酶解后，可以獲得較為完全的蛋白酶解液。加入的酶量直接影響酶解效果，經優化，第一步以20∶1的比例加入酶液，蛋白經數小時的溫浴后，溶解充分，顯示為均勻的混懸液

第一步以30∶1的比例加入時，溫浴后仍有少量蛋白沉淀存在；第二步則以30:1的比例加入酶液，這是在前期蛋白酶液反應的基礎上，補充適量酶液，使蛋白和酶液接觸充分，反應完全。兩步酶解間隔時間應適宜，不同來源樣品及前期處理方式不同，樣品的溶解性也不同，以蛋白充分溶解為準。本次實驗中做了間隔3和6 h的比較，發現間隔3 h時，蛋白溶解已較為完全，可能由于血清中蛋白本身較容易溶解，如果做組織總蛋白可能需要更長的復溶時間。實驗中還原采用的是TCEP，而未采用常用的DTT，是因為TCEP是較為溫和的還原試劑，其對已經鍵合的雙硫鍵不產生作用，這樣更為確切地顯示了蛋白固有的狀態。

3.1.2 兩種碎裂模式結合及參數優化 質譜條件的優化是采用將BSA標準品稀釋溶液直接注射進樣，流速20 nL/min。對電離電壓進行調整后，在CID/ETD切換模式下，對CID和ETD分別進行了優化。這里僅對ETD優化進行闡述，主要對反應采集時間（Reactant accu time）、截留值（Cut off）、反應時間（Reaction time）等質譜參數進行5因素4水平的正交實驗（參見表1），根據離子碎片數量和離子響應強度進行質譜參數的優化。以上5個因素對ETD碎裂方式都有不同的影響：采集時間是最重要的參數，因為反應試劑缺少不能通過任何方式補償， 通常采集時間在反應試劑離子譜圖上產生離子計數5×10⁵～6×10⁵比較合適；截留值主要是強迫被分析物和反應試劑離子在反應時間內進入到比較小的空間內，因此，較高的截留值意味著較短的反應時間，而較長的反應時間會導致碎片離子的價態降低；前體離子個數（No. of precursor ion）和反應時間則直接影響離子的檢出。本研究利用Minitab 14軟件及其預測功能對正交試驗結果進行計算，綜合考慮各個條件下的離子響應強度和碎片離子數情況，最后確定實驗中的優化參數為：反應物采集時間：10 ms

截止值：200

反應時間：100

前體離子個數：7

釋放時間（Release time）：0.8 min。

3.2 兩種酶解方式的互補性

在非標記蛋白組學測定中，酶解是至關重要的一步，其中常用的胰酶（Trypsin）的酶切位點主要是蛋白中賴氨酸（K）及精氨酸（R），均為堿性氨基酸。而蛋白酶V8則主要針對的是蛋白中天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）進行切割，均為酸性氨基酸。常規分析中，僅利用Trypsin進行酶解，由于酶解效率、酶活性以及樣品本身狀態（酸堿性）的影響，可能導致蛋白序列覆蓋率不高，如果另采用V8酶解，由于酶切肽段的互補性，會顯著提高覆蓋率。

3.2.1 總蛋白發現率 應用Trypsin和V8對大腸桿菌蛋白進行酶解，利用CID進行碎裂，對酶解結果進行搜索鑒定。Trypsin酶解后得到檢出肽段為2356（n＝5），鑒定的蛋白為517

V8酶解后得到的肽段2139 （n＝5），鑒定的蛋白為405；兩種酶解重疊的蛋白有349，各自發現的蛋白分別為168（Trypsin）和56（V8）。因此，蛋白總的發現率較單純Trypsin酶解增加了11%。

3.2.2 單個蛋白覆蓋率 分別對BSA和大腸桿菌蛋白酶解鑒定到的蛋白序列進行分析，發現BSA經兩種酶酶解，CID碎裂后，其蛋白覆蓋率分別是67%（Trypsin，n＝5）和56%（V8，n＝5），兩種酶解方式重疊的序列45%，因而總覆蓋率較單純Trypsin酶解增加了16%，總覆蓋率達到了83%。在大腸桿菌蛋白鑒定結果中選取序列長度不同的幾個蛋白進行覆蓋率的比較，覆蓋率增加了10%～20%（表2）。分別經兩種酶酶解后測定，蛋白總覆蓋率可增加10%以上。

3.3 兩種碎裂模式結合的互補性

離子阱質譜的CID碎裂模式對于肽的裂解主要針對的是質子在肽骨架上的遷移，獲得的是b和y離子；而ETD碎裂模式主要是電子聚集后，在肽骨架上進行電子遷移反應，獲得主要為c和z離子。兩種碎裂方式對肽的檢出有較強的互補性。利用BSA和大腸桿菌樣品對兩種方式結合進行了互補性評價，僅利用Trypsin酶解樣品進行說明，V8獲得相似的結果。

3.3.1 總蛋白發現率 應用CID， ETD和CID/ETD切換的3種碎裂模式分別對大腸桿菌總蛋白進行分析，經CID碎裂后得到2356個肽段（n＝5），鑒定的蛋白為517個；經ETD碎裂后得到1572個肽段（n＝5），鑒定的蛋白為341個；經CID/ETD切換模式碎裂后得到3043個肽段（n＝5），鑒定的蛋白為604個。CID/ETD切換模式分別比CID和ETD模式多鑒定出87和263個。但實驗中發現，切換模式增加了離子駐留及掃描循環時間，這對于快速色譜及掃描速度慢的質譜存在較大的影響。針對現有的儀器，比較了單純CID和ETD測定后總的結果與切換模式的結果發現，由于質譜本身掃描速度的限制，在離子累積數500000時，單純CID和ETD獲得的加和結果較切換模式下，多發現約40個蛋白；在累積數300000的情況下，則多發現約10個蛋白。另外，切換模式較加和模式下，批間重復率較差，這說明色譜和質譜的匹配性上存在問題，需要更高掃描速率的質譜以增強重現性。

3.3.2 單個蛋白覆蓋率 分別對BSA和大腸桿菌蛋白酶解鑒定到的蛋白序列進行分析，發現BSA經Trypsin酶解，CID碎裂后，其蛋白覆蓋率為67%（n＝5），ETD為52%（n ＝5），切換模式為73%（n ＝5），單純CID和ETD結果加和模式則為81%。在大腸桿菌蛋白鑒定結果中同樣選取序列長度不同的幾個蛋白進行覆蓋率的比較，覆蓋率增加了5%～18%（表3）。

3.4 酶解方式及碎裂方式并行分析

以上實驗說明，利用雙酶酶解或者兩種碎裂方式并行分析，可以有效提高蛋白組中蛋白發現率，并通過增加蛋白序列的覆蓋率提高蛋白發現的準確性。將雙酶雙裂解方式再次結合，對大腸桿菌蛋白進行并行分析，結果見表4，總的肽及蛋白數均為5次測定平均值。與常規Typsin酶解，CID碎裂模式測定的結果相比，并行方式肽段發現和蛋白檢出率分別提高了39%和20%。

采取Spectral Mill和Mascot兩種搜索引擎分別進行了搜索，表4僅示出了前者的搜索結果，Mascot結果趨勢與其相似。需要指出的是，二者存在5%～10%的偏差，這主要是由于兩種搜索引擎的計算方式的差別，但是對于基于概率的非標記蛋白組結果分析，采取兩種或者幾種搜索方式進行比較，為結果的準確性和交叉驗證提示了方向。

3.5 非標記蛋白組并行分析策略的應用

利用上述并行方式對人、豬及兔的血清進行了測定，與常規Trypsin酶解，CID碎裂模式的測定結果相比，并行方式蛋白檢出率分別提高了21%， 20%和10%。這說明采用并行策略提高了非標記蛋白組分析的效率（表5）。實驗結果表明，較之使用單個酶（通常為胰酶）酶解，一種碎裂方式（通常為CID）的蛋白組檢測方式，利用兩種酶兩種碎裂方式構成的互補性并行分析方式，在蛋白組中蛋白的發現率、數據的可靠性等方面都獲得了較大的提高，這表明蛋白組分析只有采取多個來源的數據并行結合的方式，才能為蛋白發現和鑒定的準確性提供更為全面的分析評價平臺，同時也增加了分析結果交叉驗證的幾率，促進了蛋白組分析結果向更可靠、信息涵量更大、適用更廣的分析模式發展，從而提高了在實際應用中發現有價值信息的可能性。

References

1 Issaq H J， Veenstra T D. BioTechniques， 2008， 44（5）： 697～700

2 DAI Bin， JI Kun-Mei， ZHANG Tang-Yan， PENG Xiao-Jun（戴 彬，吉坤美， 張同艷， 彭孝軍）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 38（10）：1423～1427

3 Kondo T. J. Biochem. Mol. Biol.， 2008， 41（9）： 626～634

4 Domon B， Aebersold R. Science， 2006， 312（5771）： 212～217

5 XUE Xiao-Fang， WU Song-Feng， ZHU Yun-Ping， HE Fu-Chu（薛曉芳，吳松鋒，朱云平，賀福初）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2007， 35（1）：19～24

6 Motoyama A， Yates III J R. Anal. Chem.， 2008， 80（19）： 7187～7193

7 Li J， Steen H， Gygi S P. Mol. Cell Proteomics，2003， 2（11）：1198～1204

8 Mann M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.， 2006， 7（12）： 952～958

9 Ross P L， Huang Y L N， Marchese J N， Pappin D J C. Mol. Cell Proteomics， 2004， 3（12）： 1154～1169

10 Chen R， Jiang X， Sun D， Han G， Wang F， Ye M， Wang L， Zou H. J. Proteome Res.， 2009， 8（2）： 651～661

11 Molina H， Matthiesen R， Kandasamy K， Pandey A. Anal. Chem.， 2008， 80（13）： 4825～4835

12 Wiesner J， Premsler T， Sickmann A. Proteomics.， 2008， 8（21）： 4466～4483

13 Altelaar A F， Mohammed S， Brans M A， Adan R A， Heck A J. J. Proteome Res.， 2009， 8（2）： 870～876

A Parallel Experimental Strategy for Label-free LiquidChromatography/Mass Spectrometry Proteomics Study

MIAO Lan¹， SUN Ming-Qian¹， LIN Xue²， CAO Jin^*1， LIU Ping³， XU Li¹， LIU Jian-Xun¹

¹（Research Centra， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091）

²（Cardiology Department， Peking Union Medical College Hospital， East District， Beijing 100730）

³（Institute of Clinical Pharmacology， Chinese People's Liberation Army， General Hospital， Beijing 100853）

Abstract A parallel experimental strategy for Label-free LC/MS Proteomics was developed through dual enzyme digestions and dual fragmentations methods. LC/MS coupled with collision-induced dissociation （CID） and electron transfer dissociation （ETD） was applied on proteome samples， including BSA， E. Coli， human serum， pig serum and rabbit serum， in which the samples were digested by trypsin and V8 enzyme. Comparing to the digestion by single enzyme， protein detecting ratio was enhanced by 11%， while coverages on individual protein were increased over 10% through dual enzyme digestions. The integrated fragmentation by CID/ETD on E.Coli samples identified 87 and 263 more proteins than CID and ETD only， respectively. The total protein detecting ratios were enhanced 21%， 20%， and 10%， respectively， while performing the strategy on complicated samples， such as human serum， pig serum， and rabbit serum. All results testified the experimental strategy with dual enzyme digestions and dual fragmentations promoted the efficacy of common label free proteomics analysis. With the parallel pathway， more reliable information can be collected based on complementary analysis and data cross validations.

Keywords Liquid chromatography/mass spectrometry；Proteomics；Parallel analysis

（Received 28 September 2010 accepted 10 January 2011）