分散液相微萃取-毛細(xì)管電泳法同時(shí)檢測(cè)唾液中的8種毒品

摘要 建立了分散液相微萃取與毛細(xì)管電泳光電二極管陣列檢測(cè)法檢測(cè)唾液中的阿片類、苯丙胺類及氯胺酮等8種毒品的新方法。對(duì)影響萃取富集效率的因素進(jìn)行優(yōu)化：將0.5 mL含有41 μL三氯甲烷的異丙醇混合溶液快速注入到5.0 mL樣品溶液中，分散混勻后，以4000 r/min離心5 min，移取萃取溶劑并以氮?dú)獯蹈? 再用含有內(nèi)標(biāo)物的水溶液溶解后供毛細(xì)管電泳分析。在優(yōu)化條件下，富集倍數(shù)達(dá)555～631倍；各藥物在0.15～6000 μg/L濃度范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系，r為0.9986～0.9994；檢出限為0.055～0.135 μg/L （S/N＝3）; RSD＜4.0%（n＝5）。 本方法成功應(yīng)用于唾液中8種毒品的檢測(cè)，平均加標(biāo)回收率在85.6%～99.4%之間; 檢出限為1.5～3.0 μg/L （S/N＝3）; RSD＜5.1%（n＝5）。本方法具有操作簡(jiǎn)單、富集效率高、靈敏度高和干擾小等特點(diǎn)，可用于生物樣品中痕量毒品的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 分散液相微萃取; 毛細(xì)管電泳; 阿片類毒品; 苯丙胺類毒品; 氯胺酮; 唾液

2010-12-15收稿；2011-02-22接受

本文系北京教育委員會(huì)共建項(xiàng)目計(jì)劃（No.SYS 1004100436）資助項(xiàng)目

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1 引言

毒品犯罪嚴(yán)重威脅著全球的社會(huì)安定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，成為當(dāng)今世界最嚴(yán)重的社會(huì)問題。為了有效遏制毒品犯罪，針對(duì)收繳的非法藥物和生物樣品中的毒品及代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、靈敏、有效的檢測(cè)是非常重要的。氣相色譜法^［1～3］、高效液相色譜法^［4～6］、毛細(xì)管電泳法^［7～9］等是普遍應(yīng)用的檢測(cè)方法。

在公安執(zhí)法實(shí)踐中，以唾液為檢材已成為一種簡(jiǎn)便的、無損害的并能反映血藥濃度的方法。唾液是一種超濾體液，能存留游離態(tài)的藥物成分，具備分析藥物的理想條件^［10］。與其它體液檢材相比，唾液樣品的采集不受地點(diǎn)及時(shí)間的限制，采集過程不侵犯?jìng)€(gè)人的隱私，采樣過程易于監(jiān)控，可以避免樣品的造假行為。但是生物樣品組成復(fù)雜，目標(biāo)分析物含量通常較低，因此，在對(duì)痕量分析物進(jìn)行檢測(cè)前采用一種有效的萃取、凈化技術(shù)至關(guān)重要。近年來，分散液相微萃取技術(shù)（Dispersive liquid-liquid microextraction， DLLME）^［11］備受關(guān)注。該方法是將一定體積比的有機(jī)萃取劑和分散劑的混合溶液快速注入到樣品水溶液中，分散混勻后經(jīng)離心分層，移取萃取溶劑做后續(xù)儀器分析。該方法簡(jiǎn)便、快速、成本低、富集效率高，是一種集萃取、凈化和富集于一體的環(huán)境友好型樣品前處理技術(shù)。本研究將分散液相微萃取與毛細(xì)管電泳聯(lián)用，建立了檢測(cè)唾液中甲基苯丙胺（Methamphetamine，MA），苯丙胺（Aamphetamine，AM），3，4-亞甲二氧甲基苯丙胺（3，4-Methylenedioxymethamphetamine，MDMA），4， 5-亞甲基二氧基苯丙胺（3，4-Methylenedioxyamphetamine，MDA）， 氯胺酮（Ketamine）、6-單乙酰嗎啡（6-Monoacetylmorphine，6-MAM）， 嗎啡（Morphine）及可待因（Codeine）8種毒品的新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

毛細(xì)管電泳儀，配備光電二極管陣列檢測(cè)器（CE-PDA，BECKMAN，PPACE MDQ）；TDL80-2B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；氣相色譜微量進(jìn)樣器（SGE，10 μL）；醫(yī)用注射器（上海達(dá)美醫(yī)用塑料廠，1 mL）；未涂層熔融石英毛細(xì)管（60.3 cm×75 μm i.d.，有效柱長(zhǎng)50 cm，河北永年色譜元件有限公司）。

鹽酸甲基苯丙胺、鹽酸苯丙胺，鹽酸3，4-亞甲二氧甲基苯丙胺，鹽酸4，5-亞甲基二氧基苯丙胺、鹽酸嗎啡、鹽酸單乙酰嗎啡、磷酸可待因和氯胺酮（分析純，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；利多卡因（IS：Lidocaine，≥98%，Sigma公司）作為內(nèi)標(biāo)物；甲醇、乙腈（色譜純，TEDIA公司）；無水乙醇、異丙醇、二氯甲烷（CH₂Cl₂）、三氯甲烷（CHCl₃）、四氯化碳（CCl₄）、四氯乙烷（C₂H₂Cl₄）均為分析純（天津科密歐試劑公司），使用前需重蒸以除去痕量雜質(zhì)；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所有溶液均超聲振蕩脫氣5 min，并經(jīng)0.45 μm微孔膜過濾，于4 ℃的冰箱存放待用。

2.2 DLLME萃取過程

空白唾液均取自未有染毒史的健康志愿者。取1 mL唾液，將其調(diào)至pH 9.0，加入1 mL甲醇和10 mg乙酸鋅沉淀雜質(zhì)，輕搖混勻后，以4000 r/min離心15 min，取上清液用0.45 μm微孔膜過濾，濾液待分析。

0.5 mL預(yù)處理過的樣品溶液與4.5 mL 30 mmol/L硼砂緩沖溶液（pH 9.2）置于10 mL離心管。用1 mL注射器將0.5 mL含有41 μL三氯甲烷（萃取劑）的異丙醇（分散劑）混合溶液快速注入到樣品液中，形成水/異丙醇/三氯甲烷的乳濁液體系。分析物在幾秒鐘內(nèi)被萃取至分散于溶液中的三氯甲烷微小液滴中。萃取完成后，將乳濁液體系以4000 r/min離心5 min，萃取劑則沉淀在離心管底部（沉淀相（8.0±0.2）μL）。用10 μL氣相色譜微量進(jìn)樣器移取8 μL萃取劑，置于微量進(jìn)樣瓶中，并加入10 μL含有1% HCl的乙醇溶液，于室溫下以氮?dú)獯蹈伞埩粑镉?0 μL 3 mg/L鹽酸利多卡因（內(nèi)標(biāo)物）溶液溶解后，供CE分析。

2.3 CE-UV條件

毛細(xì)管使用前分別用甲醇、水、0.1 mol/L HCl、水、0.1 mol/L NaOH、水和100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液各沖洗30 min。

100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（含20%（V/V）甲醇，pH 4.0）；分離電壓: 25 kV，工作電流約為115 μA；5 kV進(jìn)樣7 s；檢測(cè)波長(zhǎng): 214 nm；工作溫度: 25 ℃。兩次實(shí)驗(yàn)運(yùn)行之間用上述緩沖溶液沖洗3 min。

2.4 富集因子及萃取回收率計(jì)算公式

富集因子（Enrichment factor， EF）為沉淀相（C_sed）與最初水相中分析物（C₀）的濃度之比。沉淀相揮干后用20 mL 3 mg/L鹽酸利多卡因（內(nèi)標(biāo)物）溶液溶解，根據(jù)直接進(jìn)樣而得到的樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.05～200 mg/L）計(jì)算其濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 分散液相微萃取條件優(yōu)化

為獲得最佳萃取條件，對(duì)影響萃取效率的因素如萃取溶劑和分散劑的種類及用量、樣品溶液的酸度和萃取時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化。以下實(shí)驗(yàn)均使用5 mL標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，毒品的濃度均為5 μg/L，內(nèi)標(biāo)物利多卡因的濃度為3 mg/L。

3.1.1 萃取溶劑的選擇

萃取溶劑必須是不溶于水、密度比水大、易揮發(fā)且對(duì)目標(biāo)分析物有高萃取能力的有機(jī)溶劑。考察了CH₂Cl₂， CHCl₃， CCl₄ 和 C₂H₂Cl₄對(duì)目標(biāo)分析物的萃取能力。為了得到相同體積的沉淀相^［11］（8.0 μL），0.50 mL甲醇溶液中分別對(duì)應(yīng)含有83.5， 50.0， 25.3和20.0 μL的 CH₂Cl₂， CHCl₃， CCl₄和C₂H₂Cl₄萃取劑。結(jié)果見表1，低極性的CCl₄很難萃取目標(biāo)分析物，而 CHCl₃的萃取率最高。

3.1.2 分散劑的選擇

分散劑必須是易溶于水，又能溶于萃取劑的有機(jī)溶劑，本實(shí)驗(yàn)中所使用的分散劑還要求易揮發(fā)。選擇甲醇、乙腈、乙醇和異丙醇為分散劑。為了得到相同體積的沉淀相（8.0 μL），0.5 mL的甲醇、乙腈、乙醇和異丙醇溶液分別含有50.0， 48.0， 20.8和41.0 μL CHCl₃。結(jié)果見表2。異丙醇作為分散劑時(shí)具有較高的萃取率。

3.1.3 萃取劑用量的影響

考察了0.5 mL異丙醇溶液中萃取劑CHCl₃的用量（41， 46， 51， 56， 61和66 μL）對(duì)萃取效率的影響，見圖1所示。隨著萃取劑用量的增加，萃取富集因子呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著CHCl₃用量的增加，沉淀相的量也增加，導(dǎo)致富集因子下降。同時(shí)，萃取回收率基本保持不變。因此，萃取劑的最佳用量選擇41.0 μL。

3.1.4 分散劑體積的影響

采用0.25， 0.50， 0.75， 1.0和1.5 mL異丙醇，分別含有17.0， 41.0， 54.4， 65.8和81.6 μL CHCl₃，進(jìn)行萃取（圖2）。異丙醇體積為0.5 mL時(shí)，萃取率最佳。這可能因?yàn)楫惐俭w積過小時(shí)，CHCl₃不能被有效分散在樣品溶液中；當(dāng)其體積過高時(shí)，會(huì)增加目標(biāo)分析物在樣品中的溶解度。本研究分散劑體積選擇0.5 mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液（Standard solution）： 5 μg/L， 5.0 mL， pH 9.0；分散劑（Dispersive solvent）：0.50 mL異丙醇（Isopropyl alcohol）；萃取劑（Extraction solvent）：CHCl₃。

標(biāo)準(zhǔn)溶液（Standard solution）： 5 μg/L， 5.0 mL， pH 9.0；分散劑（Dispersive solvent）：異丙醇（Isopropyl alcohol）；萃取劑（Extraction solvent）： CHCl₃。

3.1.5 樣品溶液酸度的影響

調(diào)節(jié)樣品的pH值使分析物分子化，才能被有機(jī)萃取劑有效萃取。考察了樣品溶液在不同pH值條件下的萃取率（圖3）。苯丙標(biāo)準(zhǔn)溶液（Standard solution）： 5 μg/L， 5.0 mL；分散劑（Dispersive solvent）：異丙醇（Isopropyl alcohol） 0.5 mL；萃取劑（Extraction solvent）：CHCl₃ 41.0 μL。胺類毒品和氯胺酮是堿性化合物，因此其萃取率隨pH值的增加而增大。在pH≥11后，僅略有增加。然而海洛因及其代謝產(chǎn)物是兩性化合物，其在過高或過低pH值條件下以離子化形式存在，其萃取率在pH 9時(shí)達(dá)到峰值。綜合考慮，樣品溶液最佳酸度選擇pH 9。為了穩(wěn)定樣品溶液的pH值，采用30 mmol/L硼砂緩沖溶液（pH 9.2）稀釋樣品。

3.1.6 萃取時(shí)間的影響

文獻(xiàn)［11～14］表明DLLME能快速達(dá)到萃取平衡，與時(shí)間無關(guān)。這是因?yàn)檩腿┍煌耆稚⒂跇悠啡芤褐校腿”砻娣e無限大，因而具有很強(qiáng)的傳質(zhì)能力，能在極短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到萃取平衡。萃取時(shí)間極短正是DLLME的顯著優(yōu)點(diǎn)。然而，如果萃取時(shí)間太短，很難確保好的重現(xiàn)性。因此，最佳萃取時(shí)間選擇1 min。

3.2 方法的線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性

在優(yōu)化條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)溶液考察了方法的線性范圍、檢出限和重現(xiàn)性，結(jié)果見表3。8種毒品在0.15～6000 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（r）在0.9986～0.9994之間; 檢出限為0.055～0.135 μg/L（S/N＝3）; RSD為2.5%～4.0%。結(jié)果表明，本方法具有很高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性。DLLME-CE聯(lián)用技術(shù)能應(yīng)用于生物樣品中多種毒品的分析檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論與固相微萃取 （SPME）^［15］，液相微萃取 （LPME）^{［16， 17］}比較（表4），表明DLLME有更高的靈敏度。

3.3 添加毒品的實(shí)際樣品分析

上述建立的DLLME-CE-PDA技術(shù)可應(yīng)用于唾液樣品中阿片類、苯丙胺類、氯胺酮等8種毒品的分析檢測(cè)。實(shí)際樣品分析前，必須沉淀蛋白質(zhì)以釋放與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物，但同時(shí)注意避免藥物的轉(zhuǎn)化或破壞，尤其是避免6-單乙酰嗎啡水解為嗎啡。

在優(yōu)化條件下，實(shí)際加標(biāo)樣品的電泳圖見圖4。可見經(jīng)過樣品前處理，在分析窗口內(nèi)并沒有其它干擾物質(zhì)的譜峰。加標(biāo)實(shí)際樣品分析的精密度與回收率見表5。唾液中毒品的檢出限為1.5～3.0 μg/L（S/N＝3），加標(biāo)回收率為85.6%～99.4%; RSD＜5.1%。

100 mmol/L NaH₂PO₄ （pH 4.0），含20%甲醇（Containing 20% methanol）；電遷移進(jìn)樣（Electrokinetic injection）：5 kV，5 s；分離電壓（Voltage）：25 kV。 IS：利多卡因（Lidocaine）: 3 mg/L； 1：苯丙胺（Amphetamine）; 2：甲基苯丙胺（Methamphetamine）; 3：4， 5-亞甲基二氧基苯丙胺（3， 4-methylenedioxyamphetamine）; 4：3， 4-亞甲二氧甲基苯丙胺（3， 4-methylenedioxymethamphetamine）; 5：氯胺酮（Ketamine）; 6：可待因（Codeine）; 7：?jiǎn)岱龋∕orphine）; 8：6-單乙酰嗎啡（6-Monoacetylmorphine）;分析物濃度均為0. 1 mg/L（The concentration of every analyt is 0.1 mg/L）。

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Determination of Drugs of Abuse in Saliva by DispersiveLiquid-Liquid Microextraction Coupled withCapillary Zone Electrophoresis

MENG Liang¹， WANG Yan-Yan¹， MENG Pin-Jia¹， WANG Yan-Ji^*1， ZHANG Qiang²

¹（Department of Forensic Science， Chinese People′s Public Security University， Beijing 10038）

²（Bureau of Criminal Investigation， Neimenggu Department of Public Security， Hohehot 010051）

Abstract A novel method was developed for the pre-concentration and determination of eight drugs in saliva by dispersive liquid-liquid microextraction （DLLME） coupled with capillary zone electrophoresis with photo diode array detection （CE-PDA）. Parameters affecting extraction efficiency were investigated and optimized. In the method， 0.5 mL isopropyl alcohol containing 41.0 μL chloroform was rapidly injected into a 5.0-mL saliva sample. After centrifugation at 4000 r/min for 5 min， the sedimented phase was transferred into a small volume CE auto-sampler vial and evaporated to dryness. The residue was reconstituted in lidocaine hydrochloride （internal standard） aqueous solution and introduced by electrokinetic injection into CE. Under the optimum conditions， linearity of the method was observed for all target analytes in the range from 0.15 to 6000 μg/L with the correlation coefficient （r） ranging from 0.9986 to 0.9994. The LODs （S/N＝3） were estimated to be in the range from 0.055 to 0.135 μg/L. Excellent repeatability of the extraction （RSD≤4.0%， n＝5） was achieved. As high as 555 to 631 fold enrichment factors were achieved. The feasibility of this method was demonstrated by determination of drugs in saliva samples with spiked recoveries in the range of 85.6～99.4% （RSD≤5.1%， n＝5）. The method was proven to be simple and environmental benign with high enrichment factor and low cost.

Keywords Dispersive liquid-liquid microextraction; Capillary electrophoresis; Opiates; Amphetamines; Ketamine; Saliva

（Received 15 December 2010; accepted 22 February 2011）