體液中西地那非的測(cè)定及其代謝物的確認(rèn)

摘要 建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜 （ HPLC-ESI-MS/MS） 測(cè)定血液中西地那非以及利用電場(chǎng)軌道阱回旋共振組合質(zhì)譜儀（LTQ-Orbitrap）鑒定尿液中西地那非代謝產(chǎn)物的方法。用乙醚提取體液，采用Ultra IBD色譜柱，以乙腈-20 mmol乙酸銨（含0.1%甲酸）緩沖液（70∶30，V/V）為流動(dòng)相，恒流分離后，在LC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行定性與定量分析；代謝物分離鑒定選用PLRP-S聚合色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫分離后，在LTQ-Orbitrap全掃描模式下進(jìn)行代謝物鑒定。本方法在5～1000 μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為81.3%～103.3%，日內(nèi)與日間精密度RSD 均小于10%，檢出限為1.0 μg/L；尿液中檢出5種代謝產(chǎn)物，分別為N¹，N⁴-去乙基代謝物（M1），N-去甲基代謝物（M2，M3），羥化代謝物（M4）和N-甲基氧化代謝物（M5），其中M3和M5在人體尿液中為第一次檢測(cè)到。

關(guān)鍵詞 西地那非; 代謝物; 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜; 線性離子阱靜電場(chǎng)軌道阱組合質(zhì)譜; 結(jié)構(gòu)鑒定

2010-10-19收稿；2011-02-18接受

本文系質(zhì)檢公益行業(yè)科研資助專項(xiàng)（No. 10-137）

E-mail: zhuoxianyi126@126.com

1 引言

西地那非（Sildenafil），成品為西地那非的枸櫞酸鹽，商品名為“萬(wàn)艾可”，俗稱偉哥。它作為一種性藥，對(duì)于治療男性勃起功能障礙有很好療效。自1998年該藥上市以來(lái)，一直有報(bào)道使用西地那非會(huì)對(duì)嚴(yán)重心血管疾病患者產(chǎn)生影響，已有因服用西地那非治療性功能障礙引起意外死亡的報(bào)道^［1］。因此，急需建立靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的測(cè)定體液中西地那非的方法。目前，檢測(cè)西地那非的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）^［2～4］、氣相氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）^［5］、毛細(xì)管電泳色譜法^［6］、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）^［7，8］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）^［9，10］ 。國(guó)內(nèi)僅見楊士云等^［11］采用HPLC檢測(cè)全血中西地那非。

代謝物確認(rèn)在毒理學(xué)研究中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。代謝物的測(cè)定可以延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)限，更重要的是根據(jù)毒（藥）物及其代謝物濃度可以進(jìn)行臨床和法醫(yī)毒理學(xué)分析、解釋。目前，對(duì)于代謝物確認(rèn)最為常用的方法是核磁共振法（NMR）和質(zhì)譜分析法。核磁共振法雖然能夠?qū)悠愤M(jìn)行非破壞性、非選擇性分析，非常適合代謝物的研究，但其最大的缺陷是靈敏度相對(duì)較低，不適合分析低濃度代謝物，對(duì)樣品制備的要求很高；同時(shí)，NMR的動(dòng)態(tài)范圍有限，很難同時(shí)測(cè)定生物體系中共存濃度相差較大的代謝產(chǎn)物^［12］。HPLC-MS法雖然集合了HPLC高分離性和MS高靈敏度、高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，但確證化合物結(jié)構(gòu)的能力有限，不能滿足體內(nèi)復(fù)雜多樣的代謝物研究的需要^［13］。近年開發(fā)的電場(chǎng)軌道阱回旋共振組合質(zhì)譜儀（LTQ-Orbitrap），使用線性離子阱實(shí)現(xiàn)離子分離、裂解以及多級(jí)質(zhì)譜功能，在質(zhì)量準(zhǔn)確度、分辨率、動(dòng)態(tài)范圍、靈敏度以及多級(jí)質(zhì)譜能力等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)現(xiàn)生物樣本中復(fù)雜多樣代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定，將是小分子化合物及其代謝物鑒定的發(fā)展方向^{［14～16］}。本研究采用三重四極串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）建立血液中西地那非的測(cè)定方法，并將方法應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)；運(yùn)用LTQ-Orbitrap技術(shù)分離鑒定尿液中西地那非的代謝產(chǎn)物，為臨床和法醫(yī)毒理學(xué)領(lǐng)域提供技術(shù)儲(chǔ)備。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100 自動(dòng)進(jìn)樣器，API4000三重四極串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems公司）；Finnigan Surveyor液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），電場(chǎng)軌道阱回旋共振組合質(zhì)譜儀（德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

西地那非片（Sildenafil，輝瑞制藥公司），每片相當(dāng)于含100 mg西地那非。內(nèi)標(biāo)多慮平（Doxepin，Cerilliant公司），乙腈、甲酸、乙酸胺（HPLC級(jí)，F(xiàn)luka公司），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。空白血液來(lái)自無(wú)用藥史的健康志愿者。

2.2 工作溶液的配制

（1）西地那非工作溶液 將西地那非片磨粉后加入10 mL甲醇，超聲1 h，離心后，上清液用甲醇定容至100 mL，配制成1.0 g/L儲(chǔ)備液，并用甲醇逐級(jí)稀釋成10和0.1 mg/L的工作溶液，備用。（2）多慮平工作溶液 取1.0 g/L多慮平儲(chǔ)備液20 μL至10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配制成2 mg/L的工作溶液，備用。

2.3 樣品和樣品處理

2009年11月某日，浙江省某高齡男子在家中猝死，因懷疑其死亡前服用過“西地那非”，遂進(jìn)行毒化和病理的全面尸檢。送檢死者的血液、尿液等檢材于－20 ℃條件下保存，待測(cè)。取體液（血液、尿液）1.0 mL，加入5 μL多慮平內(nèi)標(biāo)溶液（2 mg/L）和1 mL的硼酸鹽緩沖液（pH 9.2），再加入3 mL乙醚，渦旋混合2 min，1650×g 離心3 min，取乙醚液，60 ℃水浴揮干，加入0.5 mL流動(dòng)相溶解，取200 μL至進(jìn)樣襯管中。

2.4 LC-MS/MS分析條件Ultra IBD液相色譜柱 （100 mm×2.1 mm×5 μm，Resteck公司），此前接Phenomenex保護(hù)柱（4 mm×2 mm）。流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）緩沖液（70∶30， V/V）；恒流，流速為200 μL/min；柱溫: 室溫；進(jìn)樣量5 μL。

電噴霧（ ESI） 離子源，正離子掃描，離子噴射電壓5.5 kV；離子源溫度450 ℃；離子源氣1（GS1）: 241 kPa；離子源氣2（GS2）: 276 kPa；氣簾氣172 kPa；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；碰撞氣:48 kPa。每個(gè)化合物選取兩個(gè)離子對(duì)進(jìn)行定性分析，第一對(duì)母離子/子離子確定為定量離子對(duì)，見表1。

電噴霧離子源，正離子模式檢測(cè)，噴霧電壓4.5 kV；毛細(xì)管溫度275 ℃；毛細(xì)管電壓 9 V；管透鏡電壓65 V。鞘氣：7.5 L/min；輔助氣：1.5 L/min；多級(jí)質(zhì)譜相對(duì)碰撞能量：HCD （45%）；精確質(zhì)量數(shù)采用外質(zhì)量校準(zhǔn)法（＜1×10^－6），校正液含咖啡因（M_W 194），MRFA （短肽 M_W 523），Ultramark （聚合物 M_W 1022～1922）；一級(jí)掃描和多級(jí)質(zhì)譜掃描選用FTMS質(zhì)量分析器，一級(jí)掃描分辨率為60000，多級(jí)掃描分辨率為7500；掃描范圍： m/z 300～800。

2.6 數(shù)據(jù)處理LTQ-Orbitrap采集譜圖通過代謝物篩查軟件MetWorks^TM 1.1.0 （Thermo scientific）分析，消除空白背景干擾，尋找符合西地那非代謝修飾的代謝產(chǎn)物質(zhì)子分子離子［M＋H］^＋，對(duì)尋找到的與西地那非原體相關(guān)度較高的可疑分子離子，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定和運(yùn)用元素組成分析軟件得到可疑西地那非代謝物的元素組成以及它們的化學(xué)式和不飽和度（環(huán)和雙鍵［RDB］），被鑒定的未知代謝物分子量誤差小于5×10^－6 amu，結(jié)合二級(jí)及多級(jí)質(zhì)譜功能對(duì)每個(gè)化合物提供更多結(jié)構(gòu)的特征相關(guān)信息，并通過Mass Frontier 5.0 （Thermo scientific）譜圖解析軟件對(duì)各個(gè)代謝產(chǎn)物的特征裂解方式進(jìn)行驗(yàn)證。

3 結(jié)果與討論

3.1 選擇性

取不同來(lái)源的空白血液， 按2.3節(jié)處理后進(jìn)樣（不加內(nèi)標(biāo)），13:39 2011-11-10按2.3節(jié)處理后進(jìn)樣，結(jié)果如圖1b；圖1c為空白血液中添加內(nèi)標(biāo)，表明空白血液中的內(nèi)源性物質(zhì)不會(huì)干擾西地那非的測(cè)定。

3.2 線性關(guān)系

取空白血液1 mL，加入西地那非工作溶液配制成5， 25， 50， 100， 500和1000 μg/L 的樣品，按2.3節(jié)處理后進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

以西地那非質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以西地那非和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：y＝0.00434x －0.0148，r＝0.9972，見圖2。結(jié)果表明，西地那非在5～1000 μg/L濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。

由于臨床治療濃度通常高于μg/L級(jí)，本研究處理后進(jìn)樣量?jī)H5 μL，得本方法的檢出限（S/N ≥3）為1 μg/L，定量限（S/N ≥10）為5 μg/L，此方法有較寬的線性范圍，便于實(shí)際樣品的定量分析。

3.3 提取回收率、精密度和基質(zhì)效應(yīng)

取空白血液1.0 mL，添加西地那非， 配制10， 100和800 μg/L低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的控制樣品，按2.3節(jié)操作，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)設(shè)6個(gè)重復(fù)樣品，按相同方法分析，連續(xù)測(cè)定3 d，按線性方程回歸計(jì)算回收率、日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果表明，此方法的日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于10%，結(jié)果見表2。

空白血液經(jīng)提取后， 加入西地那非， 采用LC-MS/MS分析，所得峰面積與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣得到的峰面積相比即得基質(zhì)效應(yīng)。提取回收率是分別在空白血液預(yù)處理前和預(yù)處理后加入西地那非，分析所得峰面積的百分比，結(jié)果見表2。

3.4 質(zhì)譜解析

采用LTQ-Orbitrap 質(zhì)譜， 在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描，對(duì)照品西地那非準(zhǔn)分子離子［M＋H］^＋m/z 475.2120（分子量誤差－0.422×10^－6），其主要碎片離子分別為m/z 377.1274， 311.1499和283.1186。由于西地那非甲砜基團(tuán)有兩個(gè)O， 有很強(qiáng)的吸電子作用，造成NS鍵和CS鍵不穩(wěn)定，容易發(fā)生斷裂，形成碎片離子m/z 377 （M＋H－C₅H₁₀N₂） 和m/z 311 （M＋H－C₅H₁₂O₂N₂S），MS³質(zhì)譜碎片離子m/z 283由MS²質(zhì)譜碎片離子m/z 311丟失C₂H₄產(chǎn)生，西地那非裂解途徑見圖3A。以上西地那非由多級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子及裂解方式分別與文獻(xiàn)［1，9，17，18，］報(bào)道一致。

對(duì)尿液進(jìn)行一級(jí)全掃描和二級(jí)Data-dependent質(zhì)譜分析，采集到的譜圖通過代謝物分析軟件MetWorks^TM 1.1.0處理，發(fā)現(xiàn)原藥西地那非及其相關(guān)的5種代謝物，它們的質(zhì)子化分子離子［M＋H］^＋精確質(zhì)量數(shù)分別為m/z 449.1957，461.1960，461.1959，491.2063和505.1854。對(duì)這些組分進(jìn)行二級(jí)Data-dependent質(zhì)譜分析，得到各個(gè)組分的MS色譜及MS²質(zhì)譜圖。西地那非及各代謝物的化學(xué)式、保留時(shí)間、積分峰面積、理論分子量、實(shí)測(cè)分子量、不飽和度（RDB）、理論值與實(shí)測(cè)值之間的相對(duì)誤差及MS²質(zhì)譜主要碎片離子見表3。從表3可知，除代謝物M3和M4外，其余代謝物在二級(jí)和多級(jí)質(zhì)譜中均出現(xiàn)相同特征碎片離子m/z 311和 283，為有效鑒定該類化合物提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。尿液中原藥西地那非二級(jí)質(zhì)譜得到的主要碎片離子與對(duì)照品西地那非二級(jí)質(zhì)譜碎片離子相同。

代謝物M1， ［M＋H］^＋（m/z 449.1957），結(jié)合原藥元素組成（C， H， O， N， S）及其精確質(zhì)量數(shù)和分子量誤差（＜5×10^－6），可推斷M1 ［M＋H］^＋化學(xué)式為C₂₀H₂₉O₄N₆S^＋，與原藥西地那非［M＋H］^＋化學(xué)式C_22H31O₄N₆S^＋比較，由失去C₂H₂， 產(chǎn)生［M＋H－C₂H₂］^＋，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 311和283，與文獻(xiàn)［19］報(bào)道M1為N¹， N⁴-去乙基化代謝物一致。

代謝物M2， ［M＋H］^＋（m/z 461.1960），結(jié)合原藥元素組成（C， H， O， N， S）及其精確質(zhì)量數(shù)和分子量誤差（＜ 5×10^－6），可推斷M2 ［M＋H］^＋化學(xué)式為C_21H29O₄N₆S^＋，與原藥西地那非［M＋H］^＋化學(xué)式C_22H31O₄N₆S^＋比較，為失去CH₂產(chǎn)生 ［M＋H－CH₂］^＋，推斷M2為原型藥物去甲基化代謝產(chǎn)物，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 311和283，表明N-去甲基化應(yīng)發(fā)生在哌嗪環(huán)上，與文獻(xiàn)［1，18，19，20］報(bào)道一致。

由代謝物M3，［M＋H］^＋的精確質(zhì)量數(shù)可推斷其化學(xué)式與M2一致，但兩者的色譜峰保留時(shí)間不同，可推測(cè)與M2互為同分異構(gòu)，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z 297和269，表明N-去甲基化應(yīng)發(fā)生在吡唑環(huán)上。Walker等^［19］對(duì)該代謝物進(jìn)行了報(bào)道，主要二級(jí)質(zhì)譜碎片離子與本實(shí)驗(yàn)一致，但只在老鼠和狗的體內(nèi)檢測(cè)到該代謝物，在人體內(nèi)未能檢測(cè)出該化合物。代謝物M3二級(jí)圖譜裂解途徑見圖3B。

代謝物M4， ［M＋H］^＋（m/z 491.2063），結(jié)合原藥元素組成（C， H， O， N， S）及其精確質(zhì)量數(shù)和分子量誤差（＜ 5×10^－6），可推斷M4 ［M＋H］^＋化學(xué)式為C_22H31O₅N₆S^＋，與原藥西地那非［M＋H］^＋化學(xué)式C_22H31O₄N₆S^＋ 比較增加一個(gè)氧原子 ［M＋H＋O］^＋，初步推斷M4為原藥的羥化代謝產(chǎn)物。二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子m/z 473，375 ，327，310，281，與文獻(xiàn)［1，20］報(bào)道一致，羥化發(fā)生在吡唑環(huán)烷烴上。

代謝物M5， ［M＋H］^＋（m/z505.1854），結(jié)合原藥元素組成（C， H， O， N， S）及其精確質(zhì)量數(shù)和分子量誤差（＜5×10^－6），可推斷M5 ［M＋H］^＋化學(xué)式為C_22H29O₆N₆S^＋，與原藥西地那非［M＋H］^＋化學(xué)式C_22H31O₄N₆S^＋比較，推斷其可能為CH₃氧化成COOH ［M＋H＋O₂－H₂］^＋。分析結(jié)果表明，代謝物M5與其它已找到的代謝物比較，M5在體內(nèi)代謝微量。由于代謝物M5一級(jí)全掃描響應(yīng)偏低，在Data-dependent 質(zhì)譜分析中未能得到多級(jí)質(zhì)譜圖，為進(jìn)一步確證代謝物M5，單獨(dú)對(duì)M5作多級(jí)質(zhì)譜掃描，所得二級(jí)質(zhì)譜圖碎片離子出現(xiàn)離子峰m/z 487和461，碎片離子m/z 487較母離子質(zhì)子分子離子［M＋H］^＋（m/z 505）減少18 amu，推測(cè)為丟失一個(gè)中性分子H₂O所致［M＋H－H₂O］^＋；碎片離子m/z 461較母離子m/z 505減少44 amu，推測(cè)其為丟失另一個(gè)中性分子CO₂所致［M＋H－CO₂］^＋。由二級(jí)質(zhì)譜碎片離子m/z 487和461產(chǎn)生的MS³質(zhì)譜圖均含特征離子m/z 311和283，結(jié)合西地那非的特征離子及裂解規(guī)律，推斷氧化可能發(fā)生在母體哌嗪環(huán)的N位甲基上。圖3C為代謝物M5的可能裂解途徑。

3.5 樣品分析

采用本方法分析2.3節(jié)中的血液和尿樣，均檢出西地那非。血液中西地那非濃度為358 μg/L。按照2004年9月國(guó)際法庭毒理組織（TIAFT）公布的血液中毒藥物治療、中毒濃度資料^［21］，西地那非的治療濃度在0.05～0.5 mg/L；對(duì)于中毒濃度，則明確表示要依據(jù)其心血管系統(tǒng)功能。本案中死者的法醫(yī)解剖發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的病理學(xué)特征，因西地那非可引發(fā)低血壓反應(yīng)，從而誘發(fā)心臟疾病發(fā)作。在文獻(xiàn)［22，23］報(bào)道的死亡案例中，血液中西地那非濃度分別為105和6270 μg/L，濃度范圍很寬。在實(shí)際個(gè)案的法醫(yī)毒理學(xué)解釋時(shí)，除需要考慮心血管系統(tǒng)功能因素外，死者的年齡、健康狀況、服藥時(shí)間、死亡時(shí)間、檢材的采集時(shí)間、部位等因素都是十分重要的因素。

運(yùn)用高分辨質(zhì)譜LTQ-Orbitrap 在死者尿液中確認(rèn)西地那非及5種代謝物。由于沒有代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，未能對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析。文獻(xiàn)［20］表明，按50 mg劑量服藥，24 h后在尿中即檢測(cè)不到西地那非原藥。根據(jù)積分峰面積判斷，原藥在本案中尿液中的含量仍較大，結(jié)合血液中西地那非濃度，可推斷該死者死亡時(shí)間應(yīng)在服藥后數(shù)小時(shí)之內(nèi)。

本研究采用高質(zhì)量精度的LTQ-Orbitrap質(zhì)譜確認(rèn)了尿液中西地那非的5種代謝物。由實(shí)際案例分析可見，綜合運(yùn)用三重四極串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）和電場(chǎng)軌道阱回旋共振組合質(zhì)譜（LTQ-Orbitrap）技術(shù)，可更準(zhǔn)確、可靠地進(jìn)行生物檢材中毒（藥）物及其代謝物的定性定量分析及結(jié)果解釋工作。

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Determination of Sildenafil in Human Blood and Confirmation ofIts Metabolites in Urine

CHEN Cong^1，2， XIANG Ping²， SHEN Bao-Hua²， ZHUO Xian-Yi^*2

¹（Forensic Medicine Department of Shanghai Medical College of Fudan University， Shanghai 200032）

²（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine， Institute of Forensic Science，Ministry of Justice， Shanghai 200063）

Abstract A method was developed to determine sildenafil in human blood by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） and identify metabolites of sildenafil in human urine by linear trap quadropole （LTQ）-Orbitrap. Body fluids were extracted with ethyl ether. Sildenafil in blood was separated using IBD column with a mobile phase consisting of acetonitrile and 20 mmol/L ammonium acetate buffer including 0.1% formic acid（70∶30， V/V）. The flow rate was 0.2 mL/min. Then the analyte was analyzed by LC-MS/MS in the positive ion mode; the incurred urine sample was separated by PLRP-S polymeric column. 0.1% formic acid（A） and acetonitrile（B） were used as mobile phase with elution gradient. The metabolites of sildenafil were aN-Alyzed by LTQ-Orbitrap. Sildenafil showed a good linear relationship over the range of 5－1000 μg/L（r＝0.9972）. The recovery of sildenafil was 81.3%－103.3% and the RSD of intra-day and inter-day precision was less than 10%. The detection limit was 1 μg/L. Five metabolites were identified in human urine: N-N-desethylsildenafil（M1）， demethysildenafil（M2， M3）， propyl-oxidated sildenafil（M4） and CH₃ to COOH sildenafil（M5）. M3 and M5 were the first reported in the human body fluids.

Keywords Sildenafil; Metabolites; High performance liquid chromatography coupled with electrospray tandem mass spectrometry; Linear trap quadrupole-orbitrap mass spectrometry; Structure confirmation

（Received 19 October 2010; accepted 18 February 2011）