支化滾環擴增均相光散射檢測單核苷酸多態性

摘要 結合簡便、高效的支化滾環擴增反應與光散射技術，建立了一種均相、無標記檢測單核苷酸多態性的方法。通過設計與突變型DNA完全匹配的鎖式探針，突變型DNA可作為模板，使鎖式探針在連接酶作用下于45℃連接成環，由Phi29 DNA聚合酶在33℃引發支化滾環擴增反應，生成大量的長鏈DNA產物。反應產物在0.2 mol/L HClO₄介質中變性、聚集，產生強烈的光散射信號。野生型DNA與鎖式探針的3 SymbolbB@ 末端有一個堿基錯配，不能使鎖式探針連接成環和引發支化滾環擴增，僅產生很弱的光散射信號。依據二者產生的光散射信號差異，可特異性區分單堿基差別。方法靈敏度高、成本低，可準確測定1 pmol/L突變型DNA和定量檢測基因突變頻率。所有的成環反應、支化滾環擴增反應及光散射測定可逐步完成，無需分離、洗滌步驟，操作方便、減小了污染的風險。

關鍵詞 單核苷酸多態性； 光散射； 支化滾環擴增

2010-10-30收稿；2011-03-07接受本文系國家自然科學基金項目（No.20875021）和河北省自然科學基金項目（Nos.B2009001525， B2009000170）資助

E-mail: lzpbd@hbu.edu.cn

1 引言

由單個堿基突變形成的基因單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是基因突變最常見的形式。研究特異性、高靈敏度的SNP檢測方法對于疾病診斷、藥物篩選以及遺傳性疾病的研究等具有重要意義^［1，2］。當前，對于SNP檢測，主要有基于芯片電泳^［3］和微陣列芯片的固相分析方法和利用熒光偏振或熒光共振能量轉移的均相檢測方法^［4］。固相分析方法特異性好，可實現高通量分析，但需要多步雜交、分離、洗滌等步驟，操作復雜。均相方法不需要分離和洗滌步驟，操作簡便，但是熒光偏振法一般具有較高的背景，靈敏度低、選擇性差。基于熒光共振能量轉移檢測SNP的方法需要在寡聚核苷酸探針的兩端進行標記，制備困難，成本高^［5］。

滾環擴增（Rolling circle amplification，RCA）是一種高效恒溫擴增方法，在RCA反應中，特異性的鎖式DNA探針（Padlock probe，PLP）以目標DNA為模板，被連接成環狀DNA，目標DNA沿環狀DNA進行不斷的延伸反應，生成大分子長鏈DNA，形成擴增反應。由于PLP連接反應對目標DNA單堿基突變具有很高的選擇性，RCA非常適合應用于SNP的均相檢測^［6］。在RCA反應過程中，加入與滾環擴增產物互補的反向引物，使其以RCA產物為模板引發反向支化擴增（Branched rolling circle amplification， BRCA），產生大量的單鏈和雙鏈的DNA產物，可進一步提高RCA檢測的靈敏度^［7］。RCA產物一般常用分子信標^［8］，核酸熒光染料^［7］和生物發光法^［9，10］等方法進行檢測。分子信標需要雙標記的核酸探針，合成成本高；核酸熒光染料容易光漂白而影響其靈敏度和重現性；生物發光法靈敏度高，但需要多步轉化反應，且需要昂貴的發光試劑。因此，進一步開發基于RCA反應的簡便、無標記的均相SNP檢測新方法一直備受關注。

近年來，光散射（Light scattering，LS）技術已廣泛應用于核酸等生物大分子的檢測中^{［11～13］}。Li等^［13］首次將大粒子散射技術用于核酸的分析，其原理是基于核酸分子在強酸性介質中變性而聚集成大粒子，產生強烈的光散射信號，實現了核酸的高靈敏度檢測。但其檢測的是基因組DNA的總量，而將其應用于SNP的檢測還未見報道。本研究結合高靈敏度BRCA反應與光散射技術，在強酸介質中，使長鏈DNA分子變性、聚集，應用光散射技術進行檢測，建立了均相SNP檢測的新方法。本方法在均相溶液中進行，無需標記和特殊試劑，實驗成本低、操作簡便、靈敏度高、特異性好。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑F-4500熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；Px2 Thermal Cycler（美國Thermo Electron公司）。RepliPHI^TM Phi29 DNA 聚合酶、Ampligase^ Thermostable DNA連接酶（美國Epicenter Biotechnologies公司）；所有合成的DNA序列（表1）和4種脫氧核苷三磷酸的混合物（dNTPs）購自大連寶生物科技有限公司；Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0基因組DNA提取試劑盒（大連）；Qiagen Qiaex II gel extraction kit膠回收試劑盒（德國Qiagen公司）；限制性內切酶Alu I 和Hinf I（美國New England Biolabs公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 鎖式探針的連接反應和BRCA反應

鎖式探針的連接反應混合溶液，包括1 U熱穩定DNA連接酶，20 mmol/L Tris-HCl （pH 8.3），25 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl₂，0.5 mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），0.01% Triton X-100，20 nmol/L PLP和適量目標DNA，反應體積為10 μL。反應混合溶液先加熱至90℃，并保持2 min，再于45℃進行45 min連接反應。在連接反應產物中加入10 μL BRCA混合液，包括80 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），100 mmol/L KCl，20 mmol/L MgCl₂，10 mmol/L （NH₄）₂SO₄和8 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），250 μmol/L dNTPs，0.2 μmol/L 鎖式探針反向引物和20 U Phi29 DNA聚合酶。BRCA反應在33 ℃進行5 h，然后加熱至70℃， 并保持10 min， 將酶失活以終止反應。

2.2.2 光散射檢測mutDNA

取BRCA反應產物5 μL加入到0.5 mL離心管中，以0.2 mol/L HClO₄稀釋至200 μL，室溫放置10 min后，在熒光分光光度計上以λ_em＝λ_ex模式進行同步波長掃描，獲得LS光譜，光譜記錄范圍為200～700 nm，在310 nm測定光散射強度。

2.2.3 突變頻率檢測

將目標DNA總量控制在20 pmol/L， mutDNA和wtDNA以不同比例（5%～100%）混合作為DNA樣品。 以混合DNA樣品進行連接反應、 BRCA反應和LS檢測， 實驗條件同2.2.2節。

2.2.4 實際樣品測定

應用TAKARA universal genomic DNA extraction kit從實驗室志愿者全血中提取基因組DNA，對p53基因exon 8進行PCR擴增（PCR引物序列見表1）。PCR程序為94℃變性5 min后進行熱循環：94℃ 變性30 s；57℃退火30 s；72℃延伸30 s；重復35個循環。以2%瓊脂糖凝膠電泳分離目標DNA片斷，用Qiagen QiaexII gel extraction kit切膠回收，測定回收產物溶液在260 nm處的吸光度進行定量分析，并進行測序。取5 μg回收樣品，用Alu I和Hinf I內切酶各5 U于37℃進行酶切處理，產生50個堿基的DNA片段用于BRCA擴增。酶切2 h后，在80℃保持20 min，使酶失活，備用。

3 結果與討論

3.1 BRCA產物的LS光譜

實驗原理如圖1所示，設計的mutPLP探針與mutDNA完全匹配，在DNA連接酶作用下，mutPLP以mutDNA為模板連接成環； mutDNA在DNA聚合酶作用下直接作為引物引發滾環擴增反應，生成長鏈DNA產物。在反向引物存在時，反向引物將不斷地沿生成的DNA長鏈反向延伸，形成BRCA反應，生成更大量的DNA產物。反應產物在強酸介質中變性、聚集而產生很強的光散射信號（圖2，曲線3）。而wtDNA與mutPLP的3 SymbolbB@ 端存在一個堿基錯配，不能使mutPLP成環和引發滾環擴增反應，僅產生很弱的光散射信號（圖2，曲線2）。依據二者光散射信號強度差異，可特異性地檢測SNP。散射光強度在310 nm處達最大值。本實驗選擇310 nm進行測定。

3.2 實驗條件的優化

3.2.1 酸濃度對散射光強度的影響

不同的強酸介質及其濃度對DNA的光散射強度有不同影響。考察了在3種強酸（HCl、三氯乙酸（TCA）和HClO₄）介質中BRCA產物的光散射，結果見圖3。在0.1～0.5 mol/L濃度范圍內，在HClO₄中，散射光強度基本保持恒定。對比另兩種酸，其信號恒定范圍更寬。本實驗選擇0.2 mol/L HClO₄為檢測介質。

3.2.2 BRCA反應溫度和時間優化

BRCA的反應溫度對產物散射光強度有較大影響。實驗表明，BRCA反應在33℃時，散射光強度較高，且由mutDNA與wtDNA產生的散射光強度差別最大。本實驗的反應溫度選擇33℃。對BRCA反應時間進行了優化。在4 h內，mutDNA進行BRCA反應產物的散射光強度隨擴增反應時間的增加而顯著增強；在4 h后，散射光強度達到最大，并基本保持不變。為了獲得較高的靈敏度及信號的穩定性，本實驗選擇5 h作為擴增反應的最佳時間。

3.2.3 單核苷酸多態性和突變頻率檢測

在上述最佳實驗條件下，考察了不同濃度的mutDNA和wtDNA與RCA產物散射光強度的關系（圖4）。在1～50 pmol/L濃度范圍內，隨mutDNA濃度的增加，BRCA反應產物量加大，導致散射光強度顯著增強；而隨wtDNA濃度增加，散射光強度增加很小，表明本方法對SNP的測定具有很高的特異性。本方法可精確檢測到1 pmol/L mutDNA。

定量測定DNA樣品中的單堿基突變頻率對研究SNP與疾病的相關性具有重要意義。本研究將mutDNA和wtDNA以不同的比例混合，作為DNA樣品，進行突變頻率檢測。實驗過程中控制mutDNA和wtDNA的總濃度為20 pmol/L，mutDNA的量分別占總量的5%，10%，20%，50%，75%和100%。如圖5所示，在310 nm時，相對光散射強度與突變頻率之間具有良好的線性關系，線性方程為I＝1.02＋0.31X（%），相關系數為0.9957。結果表明，本方法可實現定量測定DNA樣品中SNP突變頻率，而無需熒光標記和分離步驟，方法簡單、試劑便宜。

3.2.4 實際樣品的測定

在上述最佳的實驗條件下，取Alu I和Hinf I內切酶處理的PCR產物，分別應用突變型鎖式探針（mutPLP）和野生型鎖式探針（wtPLP），進行BRCA擴增及光散射檢測。如圖6所示，對220 ng PCR產物進行測定，mutPLP探針產生的LS強度與空白差別不大，而wtPLP產生較強的LS信號，wtPLP和mutPLP產生的相對LS信號強度比為25∶1，表明樣品為wtDNA型。此檢測結果與DNA測序結果（結果未給出）一致，表明本方法對SNP的檢測結果準確、可信。

4 結論

本研究建立了一種均相檢測SNP的新方法。該方法利用特異性連接反應及高效滾環擴增反應，結合光散射技術檢測，具有較高的靈敏度和特異性；實驗在均相溶液中進行，操作簡便；連接反應和擴增反應在同一個PCR管中進行，無需分離和洗滌，減少了試劑污染風險；恒溫擴增，無需精密度高的溫度循環儀器；用強酸使核酸變性檢測光散射強度，不需要特殊試劑，安全無污染且成本低。

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Homogeneous Detection of Single-Nucleotide PolymorphismUsing Branched Rolling Circle Amplification Combined withLight Scattering Technique

ZHANG Cheng， JIAO Xiao-Xia， CHENG Yong-Qiang， LI Zheng-Ping^*

（Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis Ministry of Education，College of Chemistry and Environmental Science， Hebei University， Baoding 071002）

Abstract Combined with simple and efficient branched rolling circle amplification （RCA） reaction and light scattering （LS） technique， a homogenous， lable-free method for the detection of single-nucleotide polymorphism （SNP） is presented. Designed mutant padlock probe （mutPLP）， which is perfectly complementary to mutDNA， can be ligated and cyclized at 45 ℃ in the presence of the DNA ligase. Then， mutant DNA as primer can specifically trigger branched rolling circle amplification （BRCA） reaction at 33 ℃ in the presence of phi29 DNA polymerase and generate a large number of long-chain DNA products. The long-chain DNA can be denatured and aggregated in 0.2 mol/L perchloric acid medium， resulting in a strong LS signal. In contrast， wild type DNA is mismatched with the 3′ terminal base of mutPLP so that the mutPLP cannot be cyclized and initiate BRCA reaction， resulting in a weak LS signal. Thus， a single base difference can be distinguished by comparing the LS intensity produced by mutDNA and wtDNA. This method can accurately determine the concentration of mutDNA as low as 1 pmol/L and quantify the mutant frequency of SNP. The method is sensitive and cost-effective. All the reaction of cyclization， BRCA and LS detection can be performed stepwise without separations or washing steps， which minimizes the risk of contamination.

Keywords Single nucleotide polymorphism; Light scattering; Branched rolling circle amplification

（Received 30 October 2010; accepted 7 March 2011）