碳納米管/聚吡咯修飾電極用于液相色譜測定帕金森大鼠腦中神經遞質

摘要 制備了碳納米管/聚吡咯復合修飾電極，研究了多巴胺等單胺類神經遞質在該修飾電極上的電化學行為。將此修飾電極作為電化學檢測器，與高效液相色譜聯用，測定了腦中7種神經遞質及其代謝產物。結果表明：去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺的線性范圍為5.0×10^－10～1.0×10^－5 mol/L；3，4-二羥基苯乙酸，5-羥吲哚乙酸和高香草酸的線性范圍為1.0×10^－9～5.0×10^－4 mol/L；7種物質相關系數均大于0.998；檢出限在0.1 nmol/L水平。結合微透析活體取樣，測定了自由活動帕金森模型組大鼠腦紋狀體中7種單胺類神經遞質及其代謝產物的含量，較正常組有所降低。

關鍵詞 碳納米管/聚吡咯復合修飾電極；液相色譜電化學檢測；微滲析活體取樣；神經遞質；帕金森病

2010-10-07收稿；2011-01-07接受

本文系浙江省自然基金項目（No. Y2100488）、浙江省醫藥衛生科技計劃項目（No. 2010QNA015）和溫州市科技局基金項目（No. Y20090024）資助

E-mail: proflxk@163.com

1 引言

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一種易發于中老年人的慢性神經系統變性疾病，全球65歲以上老人的發病率為2%^［1］。PD病變復雜，發病機制尚未完全闡明，其中缺乏理想的活體采樣技術和靈敏的檢測方法是影響PD研究的一個重要原因^［2］。目前，普遍認為PD的病理改變之一是腦紋狀體中神經遞質多巴胺的含量顯著性減少。因此，建立快速、準確的分析方法測定PD實驗動物發病前后神經遞質的變化，對于探討PD的病理和藥物治療研究具有重要意義。

測定腦中單胺類神經遞質及其代謝產物最常用的方法是高效液相色譜-電化學檢測法（HPLC-ECD）^［3，4］。近年來研制了各種高靈敏度的化學修飾電極，并將其應用于HPLC-ECD中，已成為重要的研究方向^［5～7］。碳納米管具有特殊的結構、獨特的電學和力學性能以及化學穩定性，已被廣泛應用在生物傳感器中^［8，9］。導電聚合物由于其在修飾電極、抗蝕涂層、分子晶體管和高性能納米催化劑的載體等方面的實際應用也在近幾年得到了廣泛關注^［10］。將納米催化劑與導電聚合膜復合是一種很好的合成新型納米材料的方法，前人已合成碳納米管/聚吡咯復合材料并研究了多巴胺在其上的電化學行為^［11］，也有學者報道將過氧化聚吡咯/碳納米管修飾電極用作液相色譜電化學檢測器來測定多巴胺^［12］。本研究制備了多壁碳納米管/聚吡咯（MWNT/PPy）復合修飾電極，并將此修飾電極作為液相色譜電化學檢測器，結合微透析活體取樣，測定了自由活動帕金森大鼠腦紋狀體中7種單胺類神經遞質及其代謝產物，為PD病理和藥物治療研究提供了一種準確、可靠的分析方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑CHI650b電化學分析儀（美國CHI公司）；三電極系統：工作電極為玻碳電極或者碳納米管/聚吡咯復合修飾電極 （ 直徑2 mm），參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為鉑絲電極。1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；安培薄層電化學檢測器（自制）。微透析系統主要由CMA 402型微透析泵（瑞典CMA/Microdialysis公司）、CMA/12型微透析探針（透析膜長度2.0 mm，直徑0.5 mm）、探針引導管和CMA 120型清醒動物活動裝置（瑞典CMA/Microdialysis公司）。腦立體定位儀（德國KOPF公司）。

多巴胺（DA）、3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-TH）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、高香草酸（HVA）和6-羥基多巴（6-OHDA）（美國Sigma Aldrich公司）。吡咯（化學純，國藥集團化學試劑有限公司），實驗前經過重新減壓蒸餾；羧基化多壁碳納米管（MWNT，直徑10～20 nm，長度0.5～50 μm，深圳市納米港有限公司）; Ringer試劑（147 mmol/L Na^＋，4.0 mmol/L K^＋，1.2 mmol/L Ca^2＋，pH 7.4），其余試劑均為分析純，溶液均用二次去離子水配制。

2.2 色譜條件XDB-C₁₈色譜柱（150 mm ×2.1 mm，5 μm，美國Aglient公司）；流動相為0.1 mol/L H₃PO₄-KH₂PO₄緩沖液（pH 3.5）與甲醇的混合液（90∶10，V/V；其中含1.0×10^－4 mol/L EDTA），流速為0.3 mL/min。電化學檢測為三電極系統：工作電極為碳納米管/聚吡咯復合修飾電極，參比電極為Ag/AgCl電極，不銹鋼基體為輔助電極。工作電位為0.6 V；進樣量為20 μL。

2.3 修飾電極的制備

對MWNT進行紅外表征。在傅立葉變換紅外光譜圖上，吸收峰出現在1716 cm^－1μC——O， COOH）和1575 cm^－1μC——O，COO）處，表明在MWNT表面有COOH和COO^－存在^［13］。

稱取1.0 mg MWNT加入10.0 mL 水，超聲波攪拌后形成0.1 g/L黑色溶液。將玻碳電極以金相砂紙、Al₂O₃粉末（0.05 μm）在麂皮上打磨至光亮，并依次在丙酮、1 mol/L NaOH溶液、HNO₃溶液（1∶1，V/V）及水中超聲清洗5 min。

（1）修飾電極的制備 將4 μL MWNT溶液滴涂到處理好的玻碳電極表面，在紅外燈下烘干，即可使用。（2）PPy修飾電極的制備 以玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，在 0.2 mol /L吡咯溶液中，在 0.0～1.0 V之間以100 mV/s的掃速循環掃描 10圈，取出并用二次蒸餾水洗凈后，再在 1.0 mol/L NaOH溶液中，于0.0～1.0 V之間循環掃描24圈，即得堿處理的PPy修飾電極。（3）/PPy復合修飾電極的制備 將含有0.2 mol/L吡咯和0.1 g/L MWNT的0.2 mol/L KCl溶液（pH 7.4）超聲分散至黑色溶液。把預處理后的玻碳電極為工作電極的三電極系統放入該溶液中，在 0.0～1.0 V之間以100 mV/s的掃速循環掃描 10圈，取出并用二次蒸餾水洗凈后，再在1.0 mol/L NaOH溶液中，于0.0～1.0 V之間循環掃描24圈，即得堿處理的MWNT/PPy復合修飾電極。

2.4 帕金森大鼠模型的制備

6-羥基多巴（6-OHDA）是選擇性單胺類神經毒素，由于其化學結構與DA類似，在腦內被誤作為神經遞質攝入到神經元內，能使DA能神經元變性死亡，造成穩定的帕金森病。所以常被用作制備PD模型，因其不能通過血腦屏障，需直接立體定向注入動物腦內^［14］。

12只雄性Sprague-Dawley大鼠（體重220～250 g，中國科學院上海實驗動物中心），隨機分成對照組和模型組，每組6只。每只大鼠用10%水合氯醛腹腔注射（0.3 mL/l00 g）麻醉后，將其頭部固定在立體定位儀上，剪毛消毒，在頭背中部縱向切口，暴露顱骨。參照《大鼠腦立體定位圖譜》^［15］，選右側紋狀體為注射區，定位坐標：前囟0.0 mm，中線右旁2.0 mm，硬膜下7.5 mm。模型組動物腦內注射用含有2.0 g/L 維生素C的生理鹽水配制而成的1.0 g/L 6-OHDA溶液10 μL，對照組腦內注射等體積含有2.0 g/L 維生素C的生理鹽水。操作過程按無菌手術規程進行，皮膚切開處給予少許青霉素粉劑。術前術后在標準條件下飼養，大鼠可自由進食、飲水。

2.5 活體微滲析取樣

動物飼養3周后，按照2.4節所述借助立體定位儀在顱腦鉆孔位置將微透析探針引導管埋入鼠腦紋狀體區域，并在引導管周圍固定3個螺絲，與引導管呈三角形排列，用牙科水泥固定。第2天，在大鼠清醒自由活動狀態下插入探針，以Ringer試劑為灌流液，1.0 μL/min的微透析速度收集樣品。為了避免外科手術帶來的損傷，前60 min的樣品被拋棄，將收集完畢的微透析樣品置于－80 ℃冰箱保存，供色譜分析。

3 結果與討論

3.1 MWNT/PPy復合修飾電極對DA的電催化氧化

圖1為不同修飾電極在含1.0×10^－5 mol/L DA的磷酸鹽緩沖溶液-甲醇混合液中的循環伏安圖。DA在4種電極上都有一對氧化還原峰，但在MWNT/PPy修飾電極上，DA的氧化還原峰電流顯著增大，表明MWNT/PPy修飾電極能有效地提高DA的電化學響應。

PPy修飾電極電極對DA的響應比裸玻碳電極強，原因是堿處理后PPy膜失去了共軛結構和導電性，使得聚合膜從一個電子/離子膜轉變為純陰離子膜。由于靜電作用，帶正電的DA能有效地被PPy膜吸引^［16］。MWNT上的羧基對DA具有很好的催化氧化作用^［12］，而對MWNT/PPy復合修飾電極而言，由于在PPy膜中摻入的MWNT是一種多孔結構，電活性物質和電解液能通過這層多孔膜擴散到膜下的導體上，能改善聚合物的電子傳遞性質，增加電極活性中心，加速DA在電極與溶液界面之間的電子傳遞，增大氧化還原峰電流^［11］。因此，在相同的條件下，MWNT/PPy修飾電極對 DA具有更良好的電催化作用。MWNT/PPy修飾電極對其它神經遞質如NE， E， DOPAC， 5-HIAA， HVA和5-HT，也有類似的催化作用。

3.2 色譜電化學條件的選擇

3.2.1 工作電極電位

以MWNT/PPy修飾電極為色譜檢測器，分別進樣7種單胺類神經遞質及其代謝產物的標準溶液（5.0 ×10^－7mol/L的DA， NE， E， 5-HT 和1.0×10^－6 mol/L的DOPAC， HVA， 5-HIAA），選擇電位范圍為0.2～0.8 V，研究7種物質在修飾電極上的流體伏安圖（圖2）。當電位高于0.5 V時，峰電流迅速增高；當電位高于0.6 V 時，峰電流增長緩慢而基底電流仍在增加，為了得到較高的信噪比，最佳工作電位選擇在0.6 V。

1. DA; 2.Norepinephrine（ NE）; 3. Epinephrine（E）;4. Epinephrine dopamine（DOPAC）; 5. 3，4-Dihydroxyphenylacetic acid（5-HIAA）; 6. 5-Hydroxyindoleacetic acid， （5-HT）;7. Homovanillic acid（HVA）.

3.2.2 流動相的pH值和甲醇含量的影響

流動相的pH值對被測物質的峰電流響應影響不大，但對保留時間的影響各不相同。對DOPAC， 5-HIAA和HVA的影響較大，而對DA， NE， E和5-HT的影響不大。當pH＞4.0 時，出現色譜峰重疊現象；當pH＝3.0～3.5時，被測物質能得到良好的分離，故本實驗流動相 pH值選擇為3.5。

在流動相中添加適量甲醇可以縮短各物質的保留時間，且保留時間隨著甲醇含量的增高而縮短。但當甲醇含量＞10%（V/V）時，出峰在前的物質（如 NE）在色譜柱上保留時間過短，無法達到基線分離；若甲醇含量＜7%（V/V），5-HT和HVA在色譜柱上保留時間過長，導致峰形變寬，故本實驗中流動相甲醇含量選擇為 10%。

綜上所述，本實驗的流動相為0.1 mol/L H₃PO₄-KH₂PO₄緩沖液（pH 3.5）與甲醇的混合液（90∶10， V/V；其中含1.0×10^{－4 mol/L} Na₂EDTA），流速為0.3 mL/min。

3.3 標準色譜圖及線性范圍、檢出限和重復性

在選定實驗條件下，以MWNT/PPy修飾電極為檢測器，5.0 ×10^－7 mol/L DA， NE， E， 5-HT 和1.0×10^{－6 mol/L} DOPAC， HVA， 5-HIAA的色譜分離圖見圖3。7種物質的濃度線性范圍及檢出限（信噪比為3∶1）如表1所示。

〖HT6〗1. NE; 2. E; 3. DOPAC; 4. DA; 5. 5-HIAA; 6. HVA; 7. 5-HT.所得的檢出限比其它修飾電極用于HPLC-ECD測定單胺類神經遞質高^［5～7］。

在相同條件下，以7種物質的混合溶液連續進樣 6次，測得NE， E， DOPAC， DA， 5-HIAA， HVA和5-HT峰電流的相對標準偏差 （RSD）分別為2.2%， 2.1%， 1.3%， 1.5%， 1.8%， 1.7%和 1.6%。此外，將MWNT/PPy修飾電極保存在4 ℃的H₃PO₄-KH₂PO₄緩沖溶液中，21 d后各被測物的電流響應變化在4.5%以內，修飾電極重復使用85次后，各被測物的電流響應變化在6.1%以內。這表明該修飾電極作為液相色譜的電化學檢測器用于測定單胺類神經遞質及其代謝產物，具有良好的穩定性和重現性。

3.4 微透析的相對回收率

微透析的相對回收率（R）是指透析液中被測物質的濃度與透析管外部介質中該物質的原始濃度之比，主要受灌流速率的影響。實驗以Ringer試劑為灌流液，分別以0.5， 0.8， 1.0， 1.5， 2.0 μL/min的灌流速率，測定7 種單胺類遞質及其代謝產物標準溶液的相對回收率。結果表明，灌流速率越大，相對回收率越小。考慮到灌流速率低，實驗時間長，樣品易變質等因素，選擇灌流速率為1.0 μL/min，測得NE， E， DOPAC， DA， 5-HIAA， HVA和5-HT標準溶液的相對回收率平均值分別為23.1%， 21.9%， 29.7%， 26.1%， 34.2%， 37.8%和34.1% （n＝5）。

3.5 動物活體分析

圖4為微透析活體取樣時帕金森模型大鼠腦紋狀體透析液在HPLC-ECD中的色譜圖。鼠腦中7種單胺類遞質的濃度可以根據離體的微透析相對回收率計算。兩組大鼠腦內微透析樣品中的單胺類神經遞質及其代謝產物分析結果如表 2所示。

通過以上單胺類神經遞質及其代謝產物在大腦中的變化可知，在帕金森病實驗大鼠腦紋狀體中，7種分析物都有所降低，尤其是DA， DOPAC和HVA的含量明顯降低，這與PD的發病機理是一致的。由于PD患者腦中的DA含量是降低的，DOPAC和HVA是反映DA代謝和轉化的指標^［17］，DOPAC是DA代謝的中間產物，而HVA則是DA代謝的終產物，二者的變化是體內DA含量變化的間接反映。因此，在PD動物腦內DA含量降低的同時，伴隨著DOPAC和HVA水平的下降。

References

1 Lees A J， Hardy J， Revesz T.Lancet.， 2009， 373（9680）: 2055～2066

2 ZHANG Wen， XU Qun， CAO Xu-Ni， LIU Mei-Chuan， JIN Li-Tong（張 文，許 群，曹旭妮，劉梅川，金利通）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2001， 29（2）: 133～137

3 LIN Li， YANG Xiao-Feng， LI Yong， QIU Pei-Hong， CAO Xu-Ni， JIN Li-Tong （林 麗，楊小鳳，李 永，仇佩虹，曹旭妮，金利通）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2005， 33（5）: 711～714

4 Kehr J， Hu X J， Yoshitake T， Scheller D. J. Chromatogr. B， 2007， 845（1）: 109～113

5 Zhang W， Cao X N， Xie Y F， Ai S Y， Jin L T， Jin J Y. J. Chromatogr. B， 2003， 785（2）: 327～336

6 Xu H H， Wang D， Zhang W， Zhu W， Yamamoto K， Jin L T. Anal. Chim. Acta.， 2006， 577（2）: 207～213

7 Lin L， Qiu P H， Yang L Z， Cao X N， Jin L T. Anal. Bioanal. Chem.， 2006， 384（6）: 1308～1313

8 ZHOU Na， YANG Tao， JIAO Kui， SONG Cai-Xia（周娜，楊濤，焦奎，宋彩霞）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 38（3）: 301～306

9 Jacobs C B， Peairs M J， Venton B J. Anal. Chim. Acta， 2010， 662（2）: 105～127

10 Sadki S， Schottland P， Brodie N， Sabouraud G. Chem. Soc. Rev.， 2000， 29（5）: 283～293

11 Li Y， Wang P， Wang L， Lin X. Biosens. Bioelectron.， 2007， 22（12）: 3120～3125

12 Wen J， Zhou L， Jin L， Cao X， Ye B C. J. Chromatogr. B， 2009， 877（20-21）: 1793～1798

13 Luo H X， Shi ZJ， Li N Q， Gu Z N， Zhuang Q K. Anal. Chem.， 2001， 73（5）: 915～920

14 Ruxandra I， Paul M， Patrik B. Behav. Brain Res.， 2005， 162（1）: 1～10

15 Paxinos G， Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates， 6th Ed.， San Diego: Elsevier Academic Press， 2009: 98～130

16 Witkowski A， Freund M S， Brajter-Toth A. Anal. Chem.， 1991， 63（6）: 622～626

17 JIN Tu-Zhang （金圖章）. Biomedical Aspects of Dopamine in Brain（腦內多巴胺的生物醫學）. Shanghai （上海）: Shanghai Science and Technology Education Press （上海科技教育出版社）， 1998 : 65～175

Liquid Chromatography with Electrochemical Detection UsingMulti-wall Carbon anotubes/Polypyrrole Composite FilmModified Electrode for in Vivo Analysis of MonoamineNeurotransmitters in Rat Striatal Microdialysate ofFreely Moving Parkinsonian Rats

LIN Li^1，2， YU Li²， LIN Rui-Po²， LI Xue-Yan²， YANG Shu-Lin¹， Li Xiao-Kun^*1，2

¹（College of Chemical Engineering， Nanjing University of Science and Technology， Nanjing 210094）

²（Department of Pharmacy， Wenzhou Medical College， Wenzhou 325035）

Abstract A multi-wall carbon nanotubes/polypyrrole modified electrode that can be used as the working electrode in the high performance liquid chromatography with electrochemical detection to determine the monoamine neurotransmitters was developed. The voltammetric response of dopamine could be promoted by using the electrode. The peak currents of norepinephrine， epinephrine， dopamine and 5-hydroxytryptamine were linear with their concentrations ranging from 5.0×10^－10 to 1.0×10^－5 mol/L， and the peak currents of 3， 4-dihydroxyphenylacetic acid， 5-hydroxyindoleacetic acid and homovanillic acid were linear with their concentrations ranging from 1.0×10^－9 to 5.0×10^－4 mol/L. The correlation coefficients of the seven compounds were more than 0.998. The detection limits were the level of 0.1 nmol/L. Coupled with in vivo microdialysis sampling， the method had been successfully applied to measure monoamine neurotransmitters in rat striatum of freely moving Parkinsonian rats， and the monoamine neurotransmitters level of model group decreased compared with control group.

Keywords Multi-wall carbon nanotube/polypyrrole composite film modified electrode; High performance liquid chromatography with electrochemical detection; In vivo microdialysis; Monoamine neurotransmitters; Parkinson′s disease

（Received 7 October 2010; accepted 7 January 2011）